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Aspekte deregulierter Genexpression im Hepatoblastom
Aspekte deregulierter Genexpression im Hepatoblastom
Das Hepatoblastom (HB) ist der häufigste maligne Lebertumor im Kindesalter. Seine Entstehung geht auf unreife Lebervorläuferzellen zurück, die eine abnormale Aktivierung von Genen der Embryonalentwicklung und Zelldifferenzierung aufweisen. Generell wird das HB mit einer guten Prognose assoziiert, welche sich allerdings bei gleichzeitiger Manifestation ungünstiger Charakteristika wie fortgeschrittenem Tumorstadium, multifokalem Wachstum oder Metastasierung deutlich verschlechtert. Die molekularen Mechanismen, die einen aggressiveren Tumorphänotyp bedingen, sind bis dato unklar. Die Analyse des Methyloms von 40 pädiatrischen Primärtumoren der Leber bestehend aus 28 Hepatoblastomen, 6 hepatozellulären Karzinomen, 3 fibrolamellären hepatozellulären Karzinomen und 3 Rhabdoidtumoren der Leber ergab zwei deutliche epigenetische Subgruppen (G1 und G2), in die sich die vier Lebertumorentitäten einfügten. Weiterführende Untersuchungen hinsichtlich ihrer globalen Methylierungsmuster, differentiell methylierten Regionen, Kopienzahlveränderungen und ihrer klinischen Relevanz legten detaillierte Charakteristika der Subgruppen offen. Während G1-Tumoren in diesen Kategorien starke Ähnlichkeit zu Normalleber-Proben zeigten, waren G2-Tumoren von einer globalen Hypomethylierung mit CpG-Insel-Hypermethylierung, globaler Instabilität und für das HB durch Assoziationen mit dem unreifen proliferativen C2-Subtyp der 16-Gen-Signatur sowie ungünstigen klinischen Parametern wie Multifokalität, Metastasierung und Wnt-Signalwegsmutationen geprägt. Eine simultane Transkriptomstudie an 11 HB-Proben bestätigte die Präsenz zweier Subgruppen und ihre klinischen Assoziationen, und verdeutlichte insbesondere durch die Inaktivierung zahlreicher Tumorsuppressorgene ein starkes Zusammenspiel von Methylom und Transkriptom. Die Überlagerung beider Datensätze legte mit TRIM71 ein neues potentielles Onkogen in G2-HBs offen, das in in vitro-Experimenten eine gesteigerte Zellproliferationsrate und Selbsterneuerungsfähigkeit bedingte. Eine mögliche Beeinflussung der Wnt-Signalwegsaktivierung konnte in HUH6-Zellen bestätigt werden, lieferte für die beobachteten Effekte auf HepT1-, Hep3B- und HUH7-Zellen jedoch keine Erklärung. Eine umfassende Analyse koexprimierter Faktoren deutete weiterhin auf eine wichtige Rolle von TRIM71 im sich selbstverstärkenden Netzwerk LIN28B-HMGA2-IGF2BP1/3 hin. Durch Expressionsstudien wurde weiterhin das Risikostratifizierungspotential der vier-miR-Signatur (let7a, miR-100, miR-371 und miR-373) in einer unabhängigen Patientenkohorte von 29 HB- und 10 Normalleber-Proben evaluiert. Das zuvor postulierte Risikostratifizierungspotential hinsichtlich des Gesamtüberlebens ließ sich aus unseren Daten nicht bestätigen und zeigte auch keine Korrelationen mit weiteren Hochrisikoparametern wie Diagnosealter, Tumorstadium, Metastasierung oder multifokalem Wachstum. Die Integration der beiden Transkriptvarianten von miR-483 in die vier-miR-Signatur, deren Expression signifikant mit Gefäßinvasion und Tumorstadium assoziiert war, führte zu einer Optimierung der Gruppenallokation und machte in der Folge eine signifikante Patientendiskriminierung mit guter und schlechter Prognose möglich. Der Vergleich von Transkriptionsprofilen metastasierter und nicht-metastasierter HBs identifizierte den Transkriptionsfaktor SP8 und den Wachstumsfaktor FGF8 als die am stärksten hochregulierten Faktoren in metastasierten Tumoren, die neben der Metastasierung auch mit dem C2-Subtyp der 16-Gen-Signatur und einer deutlich schlechteren Prognose in Verbindung standen. Die Analyse zugehöriger Methylierungsdaten legte zudem eine Demethylierung der jeweiligen Promotorregion offen. Die Anwendung der Chromatin-Immunpräzipitation deutete auf eine direkte transkriptionelle Kontrolle von FGF8 durch die Bindung von SP8 an den FGF8-Promotor hin. In vitro-Experimente wiesen eine verstärkende Wirkung von SP8 auf die Zellmotilität, Selbsterneuerung, Migration und Invasion in HB-Zellen nach und bestätigten das onkogene Potential von SP8. Langzeitexpressionsstudien von SP8 in stabil transfizierten Hep3B-Zellen manifestierten zudem eine Akquisition des mesenchymalen Phänotyps und die Hochregulation zahlreicher Gene, die die epitheliale-mesenchymale Transition anregen. Rescue-Experimente durch CRISPR interference-vermittelten Knock-down von FGF8 belegten die essentielle Rolle von FGF8 für den SP8-aktivierten aggressiven Tumorphänotyp. Die Behandlung von Hepatomzelllinien mit dem pan SP-Transkriptionsfaktorinhibitor Mithramycin A resultierte in einer signifikanten Inhibition des klonogenen Wachstums. Zusammenfassend konnten durch die fundierte Analyse des Methyloms und Transkriptoms mit TRIM71, miR-483, SP8 und FGF8 neue, potentiell onkogene Kandidaten offengelegt werden, die durch ihre Assoziationen mit Hochrisiko-Parametern neue molekulare Mechanismen der HB-Progression aufzeigten und zukünftig als prognostische Biomarker genutzt werden könnten.
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Wagner, Alexandra Elisabeth
2021
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Wagner, Alexandra Elisabeth (2021): Aspekte deregulierter Genexpression im Hepatoblastom = Aspects of dysregulated gene expression in heptoblastoma. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Das Hepatoblastom (HB) ist der häufigste maligne Lebertumor im Kindesalter. Seine Entstehung geht auf unreife Lebervorläuferzellen zurück, die eine abnormale Aktivierung von Genen der Embryonalentwicklung und Zelldifferenzierung aufweisen. Generell wird das HB mit einer guten Prognose assoziiert, welche sich allerdings bei gleichzeitiger Manifestation ungünstiger Charakteristika wie fortgeschrittenem Tumorstadium, multifokalem Wachstum oder Metastasierung deutlich verschlechtert. Die molekularen Mechanismen, die einen aggressiveren Tumorphänotyp bedingen, sind bis dato unklar. Die Analyse des Methyloms von 40 pädiatrischen Primärtumoren der Leber bestehend aus 28 Hepatoblastomen, 6 hepatozellulären Karzinomen, 3 fibrolamellären hepatozellulären Karzinomen und 3 Rhabdoidtumoren der Leber ergab zwei deutliche epigenetische Subgruppen (G1 und G2), in die sich die vier Lebertumorentitäten einfügten. Weiterführende Untersuchungen hinsichtlich ihrer globalen Methylierungsmuster, differentiell methylierten Regionen, Kopienzahlveränderungen und ihrer klinischen Relevanz legten detaillierte Charakteristika der Subgruppen offen. Während G1-Tumoren in diesen Kategorien starke Ähnlichkeit zu Normalleber-Proben zeigten, waren G2-Tumoren von einer globalen Hypomethylierung mit CpG-Insel-Hypermethylierung, globaler Instabilität und für das HB durch Assoziationen mit dem unreifen proliferativen C2-Subtyp der 16-Gen-Signatur sowie ungünstigen klinischen Parametern wie Multifokalität, Metastasierung und Wnt-Signalwegsmutationen geprägt. Eine simultane Transkriptomstudie an 11 HB-Proben bestätigte die Präsenz zweier Subgruppen und ihre klinischen Assoziationen, und verdeutlichte insbesondere durch die Inaktivierung zahlreicher Tumorsuppressorgene ein starkes Zusammenspiel von Methylom und Transkriptom. Die Überlagerung beider Datensätze legte mit TRIM71 ein neues potentielles Onkogen in G2-HBs offen, das in in vitro-Experimenten eine gesteigerte Zellproliferationsrate und Selbsterneuerungsfähigkeit bedingte. Eine mögliche Beeinflussung der Wnt-Signalwegsaktivierung konnte in HUH6-Zellen bestätigt werden, lieferte für die beobachteten Effekte auf HepT1-, Hep3B- und HUH7-Zellen jedoch keine Erklärung. Eine umfassende Analyse koexprimierter Faktoren deutete weiterhin auf eine wichtige Rolle von TRIM71 im sich selbstverstärkenden Netzwerk LIN28B-HMGA2-IGF2BP1/3 hin. Durch Expressionsstudien wurde weiterhin das Risikostratifizierungspotential der vier-miR-Signatur (let7a, miR-100, miR-371 und miR-373) in einer unabhängigen Patientenkohorte von 29 HB- und 10 Normalleber-Proben evaluiert. Das zuvor postulierte Risikostratifizierungspotential hinsichtlich des Gesamtüberlebens ließ sich aus unseren Daten nicht bestätigen und zeigte auch keine Korrelationen mit weiteren Hochrisikoparametern wie Diagnosealter, Tumorstadium, Metastasierung oder multifokalem Wachstum. Die Integration der beiden Transkriptvarianten von miR-483 in die vier-miR-Signatur, deren Expression signifikant mit Gefäßinvasion und Tumorstadium assoziiert war, führte zu einer Optimierung der Gruppenallokation und machte in der Folge eine signifikante Patientendiskriminierung mit guter und schlechter Prognose möglich. Der Vergleich von Transkriptionsprofilen metastasierter und nicht-metastasierter HBs identifizierte den Transkriptionsfaktor SP8 und den Wachstumsfaktor FGF8 als die am stärksten hochregulierten Faktoren in metastasierten Tumoren, die neben der Metastasierung auch mit dem C2-Subtyp der 16-Gen-Signatur und einer deutlich schlechteren Prognose in Verbindung standen. Die Analyse zugehöriger Methylierungsdaten legte zudem eine Demethylierung der jeweiligen Promotorregion offen. Die Anwendung der Chromatin-Immunpräzipitation deutete auf eine direkte transkriptionelle Kontrolle von FGF8 durch die Bindung von SP8 an den FGF8-Promotor hin. In vitro-Experimente wiesen eine verstärkende Wirkung von SP8 auf die Zellmotilität, Selbsterneuerung, Migration und Invasion in HB-Zellen nach und bestätigten das onkogene Potential von SP8. Langzeitexpressionsstudien von SP8 in stabil transfizierten Hep3B-Zellen manifestierten zudem eine Akquisition des mesenchymalen Phänotyps und die Hochregulation zahlreicher Gene, die die epitheliale-mesenchymale Transition anregen. Rescue-Experimente durch CRISPR interference-vermittelten Knock-down von FGF8 belegten die essentielle Rolle von FGF8 für den SP8-aktivierten aggressiven Tumorphänotyp. Die Behandlung von Hepatomzelllinien mit dem pan SP-Transkriptionsfaktorinhibitor Mithramycin A resultierte in einer signifikanten Inhibition des klonogenen Wachstums. Zusammenfassend konnten durch die fundierte Analyse des Methyloms und Transkriptoms mit TRIM71, miR-483, SP8 und FGF8 neue, potentiell onkogene Kandidaten offengelegt werden, die durch ihre Assoziationen mit Hochrisiko-Parametern neue molekulare Mechanismen der HB-Progression aufzeigten und zukünftig als prognostische Biomarker genutzt werden könnten.