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Spatiotemporal localization of proteins in microorganisms via photoactivated localization microscopy
Spatiotemporal localization of proteins in microorganisms via photoactivated localization microscopy
Photoactivated localization microscopy (PALM) is a single molecule fluorescence microscopy technique (SMLM) that relies on the controlled activation and imaging of photo-activatable/convertible fluorescent proteins to determine their position with nanometer scale precision. The analysis of SMLM data is composed of two sequential aspects: the generation of a super-resolution table/image and the subsequent analysis. In recent years, several data analysis packages dedicated to the generation of super-resolved images have been developed. These packages have been extensively characterized and compared in a community-wide effort, therefore allowing researchers to identify optimal solutions for their experiments and providing software developers with a gold standard. On the contrary, the development of data analysis packages dedicated to the study of protein coordinates has been lagging behind, and no comprehensive approach has been developed to date. Here, I present a combination of Fiji and R based scripts for the characterization, filtering and quality assurance of SMLM derived localizations. Furthermore, I demonstrate that specific conventional image analysis techniques can be applied, both quantitatively and qualitatively, to super resolution images. I then apply these analysis tools exemplarily on the characterization of the spatio-temporal localization of a novel DNA repair system in Corynebacterium glutamicum, termed Dip (DNA damage induced protein) C. Finally, I combine the multiple data analysis packages that I developed and/or adapted for the study of specific biological scenarios into a single cohesive pipeline, therefore providing a generalized and comprehensive approach toward the coordinate based analysis of the spatio-temporal localization of proteins in PALM and, in general, in SMLM. Each of the data analysis packages that comprise the pipeline is here presented together with the biological scenario that prompted its development. These include the study of magnetosome formation in Magnetospirillum gryphiswaldense, the study of the chromosome segregation machinery in C. glutamicum and the study of flagellar organization in Trypanosoma brucei., Die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) ist eine Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie Technik (SMLM), die auf der kontrollierten Aktivierung und Aufnahme von photoaktivierbaren / konvertierbaren fluoreszierenden Proteinen beruht, um ihre Position mit einer Präzision im Nanometerbereich zu bestimmen. Die Analyse von SMLM-Daten besteht aus zwei aufeinander folgenden Aspekten: der Erzeugung einer Tabelle / eines hochauflösenden Bildes und der anschließenden Analyse. In den letzten Jahren wurden mehrere Datenanalysepakete entwickelt, die sich der Berechnung der hochaufgelösten Bilder widmen. Diese Pakete wurden in gemeinschaftsweiten Anstrengungen umfassend charakterisiert und verglichen, sodass Forscher eine optimale Lösung für eigene Experimente wählen können, während Softwareentwicklern einen Goldstandard zur Hand haben. Gegensätzlich wurde jedoch die Entwicklung von Datenanalysepaketen zur spezifischen Untersuchung von Proteinkoordinaten vernachlässigt, so dass in diesem Bereich keine umfassenden Instrumente existieren. In dieser Arbeit präsentiere ich eine Kombination aus Fiji- und R basierten Skripten zur Charakterisierung, Filterung und Qualitätssicherung von SMLM Proteinkoordinaten. Darüber hinaus zeige ich, dass bestimmte konventionelle Bildanalysetechniken sowohl quantitativ als auch qualitativ auf „Superresolution“ Bilder angewandt werden können. Im Folgenden verwende Ich diese Analysewerkzeuge dann beispielhaft zur Charakterisierung der räumlich-zeitlichen Lokalisierung eines neuartigen DNA-Reparatursystems in Corynebacterium glutamicum, welches ich DipC (DNA-Schaden-induziertes Protein) genannt habe. Schließlich kombiniere ich die genannten Datenanalysepakete, die ich für die Untersuchung spezifischer biologischer Szenarien entwickelt und / oder angepasst habe, zu einer einzigen zusammenhängenden Arbeitsroutine. Diese bietet einen allgemeinen und umfassenden Ansatz für die koordinatenbasierte Analyse der räumlich-zeitlichen Lokalisierung von Proteinen aus PALM- und im Allgemeinen aus SMLM-Experimenten. Jedes der Datenanalysepakete, die in beschriebener Routine enthalten sind, wird hier zusammen mit dem biologischen Szenario vorgestellt, das zu ihrer Entwicklung geführt hat. Dazu gehören die Untersuchung der Magnetosomenbildung in Magnetospirillum gryphiswaldense, die Untersuchung der Chromosomensegregationsmaschinerie in C. glutamicum und die Untersuchung der Flagellenorganisation in Trypanosoma brucei.
SMLM, PALM, Corynebacterium glutamicum, Trypanosoma brucei, Magnetospirillum gryphiswaldense, OPTICS, co-localization
Giacomelli, Giacomo
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Giacomelli, Giacomo (2021): Spatiotemporal localization of proteins in microorganisms via photoactivated localization microscopy. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Photoactivated localization microscopy (PALM) is a single molecule fluorescence microscopy technique (SMLM) that relies on the controlled activation and imaging of photo-activatable/convertible fluorescent proteins to determine their position with nanometer scale precision. The analysis of SMLM data is composed of two sequential aspects: the generation of a super-resolution table/image and the subsequent analysis. In recent years, several data analysis packages dedicated to the generation of super-resolved images have been developed. These packages have been extensively characterized and compared in a community-wide effort, therefore allowing researchers to identify optimal solutions for their experiments and providing software developers with a gold standard. On the contrary, the development of data analysis packages dedicated to the study of protein coordinates has been lagging behind, and no comprehensive approach has been developed to date. Here, I present a combination of Fiji and R based scripts for the characterization, filtering and quality assurance of SMLM derived localizations. Furthermore, I demonstrate that specific conventional image analysis techniques can be applied, both quantitatively and qualitatively, to super resolution images. I then apply these analysis tools exemplarily on the characterization of the spatio-temporal localization of a novel DNA repair system in Corynebacterium glutamicum, termed Dip (DNA damage induced protein) C. Finally, I combine the multiple data analysis packages that I developed and/or adapted for the study of specific biological scenarios into a single cohesive pipeline, therefore providing a generalized and comprehensive approach toward the coordinate based analysis of the spatio-temporal localization of proteins in PALM and, in general, in SMLM. Each of the data analysis packages that comprise the pipeline is here presented together with the biological scenario that prompted its development. These include the study of magnetosome formation in Magnetospirillum gryphiswaldense, the study of the chromosome segregation machinery in C. glutamicum and the study of flagellar organization in Trypanosoma brucei.

Abstract

Die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) ist eine Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie Technik (SMLM), die auf der kontrollierten Aktivierung und Aufnahme von photoaktivierbaren / konvertierbaren fluoreszierenden Proteinen beruht, um ihre Position mit einer Präzision im Nanometerbereich zu bestimmen. Die Analyse von SMLM-Daten besteht aus zwei aufeinander folgenden Aspekten: der Erzeugung einer Tabelle / eines hochauflösenden Bildes und der anschließenden Analyse. In den letzten Jahren wurden mehrere Datenanalysepakete entwickelt, die sich der Berechnung der hochaufgelösten Bilder widmen. Diese Pakete wurden in gemeinschaftsweiten Anstrengungen umfassend charakterisiert und verglichen, sodass Forscher eine optimale Lösung für eigene Experimente wählen können, während Softwareentwicklern einen Goldstandard zur Hand haben. Gegensätzlich wurde jedoch die Entwicklung von Datenanalysepaketen zur spezifischen Untersuchung von Proteinkoordinaten vernachlässigt, so dass in diesem Bereich keine umfassenden Instrumente existieren. In dieser Arbeit präsentiere ich eine Kombination aus Fiji- und R basierten Skripten zur Charakterisierung, Filterung und Qualitätssicherung von SMLM Proteinkoordinaten. Darüber hinaus zeige ich, dass bestimmte konventionelle Bildanalysetechniken sowohl quantitativ als auch qualitativ auf „Superresolution“ Bilder angewandt werden können. Im Folgenden verwende Ich diese Analysewerkzeuge dann beispielhaft zur Charakterisierung der räumlich-zeitlichen Lokalisierung eines neuartigen DNA-Reparatursystems in Corynebacterium glutamicum, welches ich DipC (DNA-Schaden-induziertes Protein) genannt habe. Schließlich kombiniere ich die genannten Datenanalysepakete, die ich für die Untersuchung spezifischer biologischer Szenarien entwickelt und / oder angepasst habe, zu einer einzigen zusammenhängenden Arbeitsroutine. Diese bietet einen allgemeinen und umfassenden Ansatz für die koordinatenbasierte Analyse der räumlich-zeitlichen Lokalisierung von Proteinen aus PALM- und im Allgemeinen aus SMLM-Experimenten. Jedes der Datenanalysepakete, die in beschriebener Routine enthalten sind, wird hier zusammen mit dem biologischen Szenario vorgestellt, das zu ihrer Entwicklung geführt hat. Dazu gehören die Untersuchung der Magnetosomenbildung in Magnetospirillum gryphiswaldense, die Untersuchung der Chromosomensegregationsmaschinerie in C. glutamicum und die Untersuchung der Flagellenorganisation in Trypanosoma brucei.