Absolute nucleosome occupancy and reconstitution of nucleosome positioning mechanisms for Saccharomyces cerevisiae

Oberbeckmann, Elisa (2020): Absolute nucleosome occupancy and reconstitution of nucleosome positioning mechanisms for Saccharomyces cerevisiae. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Nucleosomes, the basic unit of chromatin, package the genome in a repetitive and non-random way. Genome-wide nucleosome maps revealed that nucleosomes form a stereotypical pattern at actively transcribed genes. This pattern is characterized by a nucleosome depleted region (NDR) upstream of the transcription start site followed by an array of regularly spaced nucleosomes. This stereotypical NDR-array pattern is pivotal for proper transcription initiation and therefore a major regulatory element for gene expression. Additionally, nucleosome positioning plays an important role in DNA replication and DNA repair. The NDR-array pattern is to some extent encoded in the DNA sequence, which is mainly read out by a combination of non-histone DNA binding proteins (general regulatory factors, GRFs) and ATP dependent chromatin remodeling enzymes (remodelers). Deletion experiments in Saccharomyces cerevisiae revealed that remodelers usually have redundant functions, whereas GRFs are essential for viability, which both complicates the detailed mechanistical dissection of these proteins in vivo. Therefore, the Korber group established a genome-wide remodeling assay with in vitro-assembled chromatin, which reconstitutes the individual contribution of each remodeling enzyme/GRF to the stereotypical NDR-array pattern. This approach revealed that some remodelers, like INO80, position in vivo-like nucleosomes on their own, whereas other remodelers, like ISW1a and ISW2, need an alignment point provided by GRFs. However, it remained unclear how remodelers generate nucleosome regularity in arrays and how arrays are aligned at GRFs. In particular, it was unclear to which extent remodelers generate the array-defining distances between nucleosomes, and between nucleosomes and GRFs by themselves, or if rather the nucleosome density and the underlying DNA sequence dominate these distances. Here, we showed that not just ISWI-type remodelers, but also INO80 as well as Chd1 align nucleosomes at GRFs and that all remodelers with spacing activity contain a ruler element as they generate remodeler-specific regular spacing in arrays and array alignment (phasing). This ruler most likely resides in the DNA-binding domain/subunit of each remodeler and can in some cases respond to nucleosome density. The extent of the nucleosomal arrays depends on the nucleosome density and mildly on the underlying DNA-sequence. Based on structural information of the INO80 remodeling complex, we generated INO80 mutants, which generated altered spacing and phasing distances in our reconstitution assay. This tuned for the first-time array generation by a remodeler and revealed the location of the ruler element in INO80. Not only the information where a nucleosome is positioned, but also how often this position is occupied, is fundamental for all nucleosome-related processes. However, all available genome-wide nucleosome mapping techniques are not able to provide nucleosome occupancy in absolute terms but rather measure nucleosome densities relative to the maximal nucleosome peak height in a single sample. To overcome this limitation, we established two orthogonal approaches to map absolute nucleosome occupancy. The first genome-wide high-resolution occupancy map of the Saccharomyces cerevisiae genome reveals that nucleosomal arrays exhibit uniformly high nucleosome occupancy. This contrasts other nucleosome maps, which often suggested drastic changes in nucleosome occupancy within single genes. Furthermore, we did not find any correlation between high transcription rates and low nucleosome occupancy as indicated by other studies, but we revealed a correlation between low nucleosome occupancy and high RSC occupancy, a nucleosome-evicting remodeling enzyme.

Abstract

Nukleosomen sind die grundlegenden Strukturelemente in Chromatin und verpacken das Genom auf eine repetitive und nicht zufällige Art und Weise. Genomweite Nukleosom-Karten zeigten, dass Nukleosomen eine stereotypische Verteilung an aktiv transkribierten Genen aufweisen. Dieses Muster ist charakterisiert durch eine nukleosomendepletierte Region (NDR) vor der Transkriptionsstartstelle gefolgt von einer Abfolge äquidistanter Nukleosomen. Dieses stereotypische NDR-Reihenmuster ist zentral für richtige Transkriptionsinitation und deshalb ein wichtiges regulatorisches Element für Genexpression. Zusätzlich spielt Nukleosomenpositionierung eine wichtige Rolle in DNA-Replikation und DNA-Reparatur. Das NDR-Reihen-muster ist teilweise in der DNA-Sequenz kodiert, welche v.a. von einer Kombination aus nicht-Histon DNA-Bindeproteinen (generelle Regulationsfaktoren, GRFs) und ATP-abhängigen Chromatinumbauenzymen (‚Remodeler‘) gelesen wird. Deletions-experimente in Saccharomyces cerevisiae zeigten, dass Remodeler normalerweise redundant arbeiten, wohingegen GRFs essenziell für die Überlebensfähigkeit der Zelle sind. Beides verkompliziert die detaillierte mechanistische Analyse dieser Proteine in vivo. Deshalb etablierte das Korber-Labor einen genomweiten Remodeler-Assay mit In vitro-Chromatin. Dieser Assay rekonstituiert die individuellen Beiträge von jedem Remodeler oder GRF zu dem stereotypischen NDR-Reihenmuster. Dieser Ansatz zeigte, dass einige Remodeler, wie ISW1a und ISW2 aus Hefe, einen Bezugspunkt brauchen in Form von GRFs. Trotzdem blieb es unklar, wie genau Remodeler Regularität in Nukleosomenabfolgen erzeugen und wie diese Nukleosomenabfolgen an den GRFs ausgerichtet werden. Speziell war unklar, bis zu welchem Grad Remodeler die reihendefinierenden Abstände zwischen Nukleosomen und zwischen GRFs und Nukleosomen selbst einstellen oder ob eher die Nukleosomendichte und die zugrundeliegende DNA-Sequenz diese Abstände dominieren. Hier zeigen wir, dass nicht nur Remodeler vom ISWI-Typ, sondern auch INO80 und Chd1 aus Hefe Nukleosomen an GRFs ausrichten können und dass alle Remodeler, die reguläre Nukleosomenabstände erzeugen, ein strukturelles Element ähnlich einem Lineal besitzen, da sie Remodeler-typische reguläre Abstände innerhalb Nukleosomreihen oder zwischen Nukleosomreihen und Ausrichtungspunkt erzeugen. Dieses Lineal-Element liegt wahrscheinlich in der DNA-binde-Domäne/Untereinheit des einzelnen Remodelers und in manchen Fällen reagiert dieses Lineal auf die Nuklesomendichte. Das Ausmaß der Nukleosomreihung hängt hauptsächlich von der Nukleosomendichte ab und teilweise von der DNA-Sequenz. Basierend auf strukturellen Daten des INO80-Komplexes konnten wir INO80-Mutanten erzeugen, welche veränderte Abstände in unserem Rekonstitutionssystem einstellten. So gelang zum ersten Mal die Manipulation der Bildung von Nukleosomreihen durch einen Remodeler. Zudem identifizierte es die Lage des Lineal-Elementes in INO80. Nicht nur die Information, wo ein Nukleosom positioniert ist, sondern auch wie oft es diese Position besetzt, ist fundamental für alle nukleosomen-abhängigen Prozesse. Nichtsdestotrotz sind alle verfügbaren genomweiten Methoden zur Kartierung von Nukleosomen nicht in der Lage, den Nukleosomenbesetzungsgrad vollständig zu messen. Stattdessen messen diese Methoden eher eine Nukleosomendichte, die relativ zur maximalen Nukleosomenbesetzung ein jeder Probe berechnet wird. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir zwei orthogonale Methoden entwickelt, die absolute Nukleosomenbesetzung messen. Die daraus resultierende erste genomweite, hochauflösende Nukleosomen-Besetzungskarte für das Saccharomyces cerevisiae Genom zeigt Nukleosomreihen mit gleichmäßig hoher Nukleosomenbesetzung. Das steht im Gegensatz zu anderen Nukleosomkarten, die oft einen zweifachen Unterschied zwischen Nukleosomenbesetzung in demselben Gen suggerieren. Des Weiteren konnten wir keine Korrelation zwischen hohen Transkriptionsraten und niedriger Nukleosomenbesetzung feststellen, obwohl andere Studien darauf hinweisen. Jedoch konnten wir eine Korrelation zwischen niedriger Nukleosomenbesetzung und dem vermehrten Vorkommen des Remodelers RSC ableiten, welcher Nukleosomen entfernt.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: chromatin, nucleosome, ATP-dependent nucleosome remodeler, in vitro, nucleosome occupancy, nucleosome positioning
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 24. Juli 2020
• 1. Bericht­erstatter:in: Korber, Philipp