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Streptomyces venezuelae: a source of ECF-sigma factors for genetic switches and a model for antibiotic resistance studies
Streptomyces venezuelae: a source of ECF-sigma factors for genetic switches and a model for antibiotic resistance studies
The soil is a challenging habitat where microorganisms are exposed to adverse environmental conditions and where they compete for space and resources. Surviving in such situations requires bacteria to permanently monitor their environment and initiate the appropriate responses to counteract the deleterious effects of a given adverse condition. For this, bacteria have sophisticated systems to sense environmental changes and elaborate specialized responses in order to overcome conditions that could cause harm. These systems are i) one-component system (1CS), ii) two-component systems, and iii) extracytoplasmic function (ECF) σ factors. Streptomycetes are gram-positive soil bacteria with a complex life cycle, being antibiotic producers and also antibiotic resistant. Additionally, these bacteria present one of the highest repertoires of ECF σ factors making them the ideal model organism for this study. The aims of this study were to i) use of ECF σ factors of S. venezuelae to design and implement orthogonal switches in B. subtilis and ii) elucidate the mechanisms of resistance against antimicrobial peptides in S. venezuelae. The performance of the ECF19-based switch was tested in the presence of its anti-σ factor, upon variation in copy number of each constituent transcriptional unit, type of inducible promoter, ECF σ factor stability and under the effects of antisense transcription. This systematic characterization of the ECF19 switch has shown it is the best performing heterologous ECF-based switch so far described for B. subtilis. Its activity is nonetheless compromised by genetic perturbations caused by changes in the copy number, protein stability and antisense transcription. This study also demonstrates that S. venezuelae is highly resistant to the antimicrobial peptide bacitracin. By performing random mutagenesis followed by genome sequencing and RNAseq analysis, it was possible to identify the genes that might be involved in bacitracin resistance in S. venezuelae., Der Erdboden ist ein herausforderndes Habitat, in dem Mikroorganismen widrigen Umwelteinflüssen ausgesetzt sind und zusätzlich um Raum und Ressourcen konkurrieren müssen. Um in solchen Situationen überleben zu können, sind die Bakterien permanent darauf angewiesen, ihre Umgebung zu überwachen. Bei gegebenen ungünstigen Bedingungen müssen entsprechende angemessene Reaktionen initiiert werden, damit sie diesen schädlichen Effekten entgegen wirken zu können. Für diese Aufgabe stellen Bakterien komplexe Systeme bereit, die die Umweltveränderungen wahrnehmen und spezialisierte Antworten auslösen, um Bedingungen zu überwinden, die Schäden verursachen können. Diese Systeme sind i) Einkomponentensysteme (1CS), ii) Zweikomponentensysteme (2CS) und iii) extracytoplasmic function (ECF)-Sigmafaktoren. Streptomyceten sind grampositive Bodenbakterien mit komplexen Lebenszyklen, die Antibiotika produzieren aber auch selbst antibiotische Resistenzen aufweisen. Zusätzlich stellen diese Bakterien ein sehr breites Repertoire an ECF-Sigmafaktoren bereit, was sie zu einem optimalen Modellorganismus für diese Arbeit macht. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, i) die Nutzung von ECF-Sigmafaktoren in S. venezuelae zu erläutern, darauf aufbauend orthogonale Schalter in B. subtilis zu konzipieren und zu implementieren. ii) Des Weiteren sollten die Mechanismen der Resistenz gegen antimikrobielle Peptide in S. venezuelae aufgeklärt werden. Die Leistungsfähigkeit des, auf ECF19 basierenden, Schalters wurde unter verschiedenen Bedingungen getestet: in der Anwesenheit seines anti-Sigmafaktors, nach Veränderung der Kopiezahl jeder einzelnen Transkriptionseinheit, unter der Kontrolle unterschiedlicher Typen des induzierenden Promoters, auf Stabilität des ECF-Sigmafaktors und auf den Effekt der antisense-Transkription. Diese systematische Charakterisierung des ECF19-Schalters hat gezeigt, dass es sich dabei um einen heterologen ECF-Schalter mit der besten Leistung in B. subtilis handelt, die bisher beschrieben wurde. Die Aktivität des Schalters wird allerdings beeinträchtigt durch genetische Störungen, die durch Änderungen der Kopiezahl, der Proteinstabilität und antisense-Transkription hervorgerufen werden. Diese Arbeit hat weiterhin demonstriert, dass S. venezuelae hochresistent gegen das antimikrobielle Peptid, Bacitracin, ist. Aufgrund der Durchführung von zufälliger Mutagenese, gefolgt von Genomsequenzierung und RNAseq war es möglich, Gene zu identifizieren, die höchstwahrscheinlich in der Bacitracin-Resistenz in S. venezuelae eine wichtige Rolle spielen.
Streptomyces venezuelae, Bacillus subtilis, genetic switches, ECF-sigma factors, bacitracin resistance, antimicrobial peptides
Rodrigues Araújo, Dayane Cristiny
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Rodrigues Araújo, Dayane Cristiny (2019): Streptomyces venezuelae: a source of ECF-sigma factors for genetic switches and a model for antibiotic resistance studies. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

The soil is a challenging habitat where microorganisms are exposed to adverse environmental conditions and where they compete for space and resources. Surviving in such situations requires bacteria to permanently monitor their environment and initiate the appropriate responses to counteract the deleterious effects of a given adverse condition. For this, bacteria have sophisticated systems to sense environmental changes and elaborate specialized responses in order to overcome conditions that could cause harm. These systems are i) one-component system (1CS), ii) two-component systems, and iii) extracytoplasmic function (ECF) σ factors. Streptomycetes are gram-positive soil bacteria with a complex life cycle, being antibiotic producers and also antibiotic resistant. Additionally, these bacteria present one of the highest repertoires of ECF σ factors making them the ideal model organism for this study. The aims of this study were to i) use of ECF σ factors of S. venezuelae to design and implement orthogonal switches in B. subtilis and ii) elucidate the mechanisms of resistance against antimicrobial peptides in S. venezuelae. The performance of the ECF19-based switch was tested in the presence of its anti-σ factor, upon variation in copy number of each constituent transcriptional unit, type of inducible promoter, ECF σ factor stability and under the effects of antisense transcription. This systematic characterization of the ECF19 switch has shown it is the best performing heterologous ECF-based switch so far described for B. subtilis. Its activity is nonetheless compromised by genetic perturbations caused by changes in the copy number, protein stability and antisense transcription. This study also demonstrates that S. venezuelae is highly resistant to the antimicrobial peptide bacitracin. By performing random mutagenesis followed by genome sequencing and RNAseq analysis, it was possible to identify the genes that might be involved in bacitracin resistance in S. venezuelae.

Abstract

Der Erdboden ist ein herausforderndes Habitat, in dem Mikroorganismen widrigen Umwelteinflüssen ausgesetzt sind und zusätzlich um Raum und Ressourcen konkurrieren müssen. Um in solchen Situationen überleben zu können, sind die Bakterien permanent darauf angewiesen, ihre Umgebung zu überwachen. Bei gegebenen ungünstigen Bedingungen müssen entsprechende angemessene Reaktionen initiiert werden, damit sie diesen schädlichen Effekten entgegen wirken zu können. Für diese Aufgabe stellen Bakterien komplexe Systeme bereit, die die Umweltveränderungen wahrnehmen und spezialisierte Antworten auslösen, um Bedingungen zu überwinden, die Schäden verursachen können. Diese Systeme sind i) Einkomponentensysteme (1CS), ii) Zweikomponentensysteme (2CS) und iii) extracytoplasmic function (ECF)-Sigmafaktoren. Streptomyceten sind grampositive Bodenbakterien mit komplexen Lebenszyklen, die Antibiotika produzieren aber auch selbst antibiotische Resistenzen aufweisen. Zusätzlich stellen diese Bakterien ein sehr breites Repertoire an ECF-Sigmafaktoren bereit, was sie zu einem optimalen Modellorganismus für diese Arbeit macht. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, i) die Nutzung von ECF-Sigmafaktoren in S. venezuelae zu erläutern, darauf aufbauend orthogonale Schalter in B. subtilis zu konzipieren und zu implementieren. ii) Des Weiteren sollten die Mechanismen der Resistenz gegen antimikrobielle Peptide in S. venezuelae aufgeklärt werden. Die Leistungsfähigkeit des, auf ECF19 basierenden, Schalters wurde unter verschiedenen Bedingungen getestet: in der Anwesenheit seines anti-Sigmafaktors, nach Veränderung der Kopiezahl jeder einzelnen Transkriptionseinheit, unter der Kontrolle unterschiedlicher Typen des induzierenden Promoters, auf Stabilität des ECF-Sigmafaktors und auf den Effekt der antisense-Transkription. Diese systematische Charakterisierung des ECF19-Schalters hat gezeigt, dass es sich dabei um einen heterologen ECF-Schalter mit der besten Leistung in B. subtilis handelt, die bisher beschrieben wurde. Die Aktivität des Schalters wird allerdings beeinträchtigt durch genetische Störungen, die durch Änderungen der Kopiezahl, der Proteinstabilität und antisense-Transkription hervorgerufen werden. Diese Arbeit hat weiterhin demonstriert, dass S. venezuelae hochresistent gegen das antimikrobielle Peptid, Bacitracin, ist. Aufgrund der Durchführung von zufälliger Mutagenese, gefolgt von Genomsequenzierung und RNAseq war es möglich, Gene zu identifizieren, die höchstwahrscheinlich in der Bacitracin-Resistenz in S. venezuelae eine wichtige Rolle spielen.