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Familiäre Alzheimer Mutationen: Untersuchung molekularer Pathomechanismen und deren pharmakologische Modulation
Familiäre Alzheimer Mutationen: Untersuchung molekularer Pathomechanismen und deren pharmakologische Modulation
Die Alzheimer-Erkrankung ist die häufigste Ursache von Demenz und damit eine große Herausforderung für die gesamte Gesellschaft. Da bislang wirksame Medikamente fehlen, steht die Wissenschaft unter großem Druck mögliche Zielmoleküle für neue Therapieoptionen zu identifizieren. Um genauere Einblicke in den Entstehungsprozess der Krankheit zu gewinnen, werden besonders mit der familiären Form der Krankheit (FAD, engl. familial Alzheimer’s disease) verknüpfte Mutationen untersucht. Die meisten dieser Mutationen betreffen Präsenilin-1 (PS1) und sein Homolog Präsenilin-2, die als katalytischer Teil des γ Sekretasekomplexes für die Spaltung eines C-terminalen Fragmentes (CTFβ) des Amyloidvorläuferproteins (APP, engl. amyloid precursor protein) in verschiedene Amyloid-β-(Aβ-)Peptide verantwortlich sind. Da das bei FAD verstärkt produzierte, längere Aβ42 als primärer Auslöser der Krankheit angesehen wird, ist ein genaues Verständnis der Produktion längerer Aβ-Spezies von entscheidender Bedeutung, um gegen Aβ gerichtete Wirkstoffe zu entwickeln. Im Rahmen dieser Arbeit wurden spezielle PS1-FAD-Mutationen, wie V261F und L435F, untersucht, die eine stark verringerte Gesamtaktivität und eine beeinträchtigte PS1-Endoproteolyse zur Folge haben. Da sie aber trotz der geringen Aβ-Produktion die Alzheimer-Erkrankung verursachen, stellte sich die Frage, ob wirklich eine veränderte Aβ-Produktion oder eher die Inhibition der Prozessierung anderer γ-Sekretasesubstrate der Auslöser der Krankheit ist. In Zellkulturexperimenten und durch Färbungen von Hirnschnitten von Patienten konnte gezeigt werden, dass diese Mutanten vermehrt toxisches Aβ43 produzieren und so ein stark erhöhtes Aβ42+43/Aβ40-Verhältnis verursachen. Damit erklärt die bisher übersehene, verstärkte Produktion von Aβ43 die Pathogenität der hier untersuchten PS1-Mutanten. Die Produktion längerer Aβ-Spezies durch die FAD-Mutanten wird auf eine verringerte Stabilität des Präsenilin-Aβn-Komplexes und eine damit einhergehende verstärkte Dissoziation der längeren Aβ-Spezies zurückgeführt. Die Ursache dieser Destabilisierung ist jedoch noch nicht bekannt. Um dies genauer zu beleuchten, wurden verschiedene Aβ43 produzierende PS1-Mutanten genauer untersucht, darunter sowohl Mutanten mit normaler als auch mit verringerter Gesamtaktivität. Dabei veränderten alle untersuchten Mutanten die Interaktion zwischen der γ-Sekretase und dem Substrat CTFβ im Bereich um die Schnittstellen der γ-Sekretase. Diese Fehlpositionierung des Substrats deutet auf eine veränderte Konformation des Enzym-Substrat-Komplexes hin, die letztlich zu dessen verringerter Stabilität führen könnte. Da die längeren Aβ-Spezies allgemein als Auslöser der Alzheimer-Erkrankung angesehen werden, ist die Reduktion von Aβ die vorherrschende Behandlungsstrategie, etwa durch Aktivierung des Aβ-Abbaus durch Immunisierung mit anti-Aβ-Antikörpern oder durch Inhibition der Aβ produzierenden β- und γ-Sekretase. Dabei treten jedoch, vor allem im Fall der γ-Sekretaseinhibitoren, starke Nebenwirkungen auf. Eine mögliche Alternative stellen γ-Sekretasemodulatoren (GSMs) dar, da sie die γ-Sekretase nicht inhibieren, sondern die Produktion der verschiedenen Aβ-Spezies in Richtung der kürzeren Formen verschieben, und so weniger Nebenwirkungen verursachen sollten. Anders als zwei zuvor beschriebene GSMs, reduzierte der hier vorgestellte neue GSM RO7019009 die Aβ43-Produktion der untersuchten Mutanten deutlich. Selbiges galt auch für Aβ42, wobei einige Mutationen erst bei deutlich höheren Konzentrationen des Modulators reagierten. Wie erwartet, wurden im Gegenzug vermehrt kürzere Aβ37- und Aβ38-Peptide gebildet. Hierbei zeigten sich, wie schon bei der Aβ42-Reduktion, mutantenspezifische Unterschiede. Manche Mutanten (z.B. V261F und L435F) sekretierten beide kurze Spezies, während andere nur die Aβ38-Produktion erhöhten. Die Produktion der unterschiedlichen Aβ-Spezies in den beiden Aβ-Produktlinien wurde bei verschiedenen PS1-Mutationen also individuell moduliert. Um die Wirksamkeit von GSMs nicht nur in vitro, sondern auch in vivo zu untersuchen, wurden Mäuse, welche die »schwedische« APP-FAD-Mutation exprimieren, über einen Zeitraum von 6 Monaten mit dem GSM RO5506284 behandelt und longitudinal mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) untersucht. Nach Abschluss der Untersuchung wurden die Gehirne der Tiere zusätzlich biochemisch und immunhistochemisch untersucht und die Ergebnisse miteinander verglichen. Dabei zeigte sich, dass der GSM den Anstieg der Amyloidsignale, also das Fortschreiten der Aβ-Pathologie, im Gehirn verringern und die Mengen an abgelagertem Aβ42 reduzieren konnte. Tiere, die zu Beginn der Behandlung schon viel Aβ-Pathologie aufwiesen, reagierten weniger stark auf die Modulation als Tiere mit niedrigen Ausgangswerten, die besser auf die Behandlung ansprachen. Die gesamte Plaquefläche ließ sich durch die Behandlung reduzieren, dabei wurde vor allem die Bildung neuer, kleiner Plaques verhindert, während sich das verbliebene Aβ immer noch an bereits vorhandene Plaques anlagern konnte. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung eines frühen Beginns der Behandlung, möglichst vor oder zu Beginn der Aβ-Pathologie. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass nahezu inaktive PS1-FAD-Mutanten erhöhte Mengen Aβ43 produzieren und so trotz sehr geringer Aβ-Sekretion die Krankheit in Einklang mit der Amyloid-Hypothese auslösen können. Eine der Ursachen für die erhöhte Produktion längerer Aβ-Spezies bei diesen und anderen Aβ43-produzierenden Mutanten könnte die, durch die Mutationen induzierte, Fehlpositionierung des Substrats sein. Im Weiteren konnte gezeigt werden, dass neuere GSMs in vitro und in vivo die Mengen längerer Aβ-Spezies, auch bei PS1-FAD-Mutanten, verringern können und sie daher eine mögliche Therapieoption darstellen., Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia and thus causes enormous problems for patients and society. Since no disease-modifying therapy is available so far, there is need for the development of new, effective and affordable drugs. In order to achieve this, the pathogenesis of AD has to be elucidated in more detail. As familial Alzheimer’s disease (FAD) linked mutations in presenilin-1 (PS1) are the main cause of early onset AD, they are an important tool to understand the detailed pathomechanism. PS1 and its homolog presenilin-2 form the catalytic subunit of the intramembraneprotease complex γ-secretase, which catalyses the final steps of amyloid precursor protein (APP) processing. γ-Secretase cleaves the APP C-terminal fragment (CTFβ) into different amyloid-β (Aβ) species. FAD mutations in PS1 increase the production of longer Aβ42, which is thought to be the main trigger of the disease. Therefore, a better understanding of the molecular consequences of these mutants could help to develop new drugs. In this study, a special type of PS1 FAD mutants (e.g. V261F, L435F) was investigated. These mutants have a strongly reduced total activity and show impaired endoproteolysis. Although the total Aβ levels produced by these mutants are very low, they still cause the disease. This led to the hypothesis that inhibited processing of other γ-secretase substrates, not increased levels of longer Aβ species, is the relevant disease trigger. However, it could be shown that these mutants produce high relative amounts of the neurotoxic and aggregation prone Aβ43. Consistently, brain sections of PS1 L435F mutation carriers presented a drastically increased Aβ43 staining compared to controls. This previously overlooked Aβ43 production leads to increased Aβ42+43/Aβ40 ratios that could cause AD in line with the amyloid hypothesis. These findings contradict the hypothesis of decreased processing of other γ-secretase substrates as disease trigger and support the idea that lowering the levels of long Aβ species is a good approach for successful treatment strategies. In general, the increased production of longer Aβ species by FAD mutants is explained by a decreased stability of the presenilin-Aβn complex, which causes the dissociation of the longer Aβ species before they can be cleaved further. However, the cause of this destabilization remains unknown. By analysing two different sets of Aβ43-producing PS1 FAD mutants, including both normally endoproteolysed and virtually inactive mutants, it could be shown that all these mutants change the binding of the Aβ precursor CTFβ to the active site of the protease. This mispositioning of the substrate indicates a changed conformation of the substrate-enzyme complex, which can be a possible explanation for the decreased complex stability in FAD mutants. As Aβ is widely accepted as primary disease trigger, current therapeutic approaches try to lower Aβ levels either by activation of the Aβ clearance through immunization or by inhibition of the Aβ-producing β- and γ-secretases. The latter approach faces the problem that inhibition γ-secretase led to severe side effects in clinical trials. γ-Secretase modulators (GSMs) are small molecules that shift the Aβ production towards shorter peptides, thereby reducing the amount of toxic Aβ42/43. However, they do not alter the total γ-secretase activity. The new GSM RO7019009, which was tested in this study, efficiently reduced Aβ43 production for all investigated mutants. Aβ42 production was reduced in these mutants as well, although some of them only responded at higher GSM concentrations. Consequently, the production of Aβ38 was increased upon RO7019009 treatment for all the mutants, while only some mutants (e.g. V261F, L435F) increased the production of both short species Aβ37 and Aβ38. These findings indicate that RO7019009 acts differently on both Aβ product lines depending on the individual PS1 mutant. In an additional part of the study, GSM function was assessed in vivo. Transgenic mice, expressing the »swedish« APP FAD mutant, were treated for 6 months with the GSM RO5506284. During the experiment, amyloid levels were monitored longitudinally by positron emission tomography (PET). After the treatment, the mouse brains were analysed biochemically and immunohistochemically in order to be compared with the PET-measurements. The amyloid levels measured by PET increased significantly slower in the treated animals compared to the control group. RO5506284 treatment reduced the amount of deposited Aβ42 in the brain. In addition, the amyloid plaque area was smaller in GSM-treated animals, which showed lesser smaller plaques and more large ones. This indicates that the reduction of Aβ by the GSM was strong enough to inhibit plaque formation; however, the remaining Aβ still was able to attach to already formed plaques. Interestingly, amyloid levels at the beginning of the treatment predicted its efficiency. Animals with high initial amyloid levels were less reactive towards the GSM, while animals with low starting amyloid levels responded well. These results underline the importance of an early treatment since GSM treatments seem to be more effective when there is no or only little plaque pathology present. Taken together, this thesis shows that virtually inactive PS1 FAD mutations secrete high relative amounts of the neurotoxic Aβ43, which could be responsible for the pathogenicity of these mutations. These and other Aβ43-producing mutations cause a mispositioning of the substrate that could contribute to the increased production of longer Aβ species by FAD mutants. In addition, the investigated GSMs were able to decrease these longer Aβ species in vitro and in vivo and could therefore be a promising therapeutic approach for AD.
Familiäre Alzheimer-Erkrankung, Präsenilin, Amyloid-β, γ-Sekretase, γ-Sekretasemodulatoren
Trambauer, Johannes
2020
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Trambauer, Johannes (2020): Familiäre Alzheimer Mutationen: Untersuchung molekularer Pathomechanismen und deren pharmakologische Modulation. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Die Alzheimer-Erkrankung ist die häufigste Ursache von Demenz und damit eine große Herausforderung für die gesamte Gesellschaft. Da bislang wirksame Medikamente fehlen, steht die Wissenschaft unter großem Druck mögliche Zielmoleküle für neue Therapieoptionen zu identifizieren. Um genauere Einblicke in den Entstehungsprozess der Krankheit zu gewinnen, werden besonders mit der familiären Form der Krankheit (FAD, engl. familial Alzheimer’s disease) verknüpfte Mutationen untersucht. Die meisten dieser Mutationen betreffen Präsenilin-1 (PS1) und sein Homolog Präsenilin-2, die als katalytischer Teil des γ Sekretasekomplexes für die Spaltung eines C-terminalen Fragmentes (CTFβ) des Amyloidvorläuferproteins (APP, engl. amyloid precursor protein) in verschiedene Amyloid-β-(Aβ-)Peptide verantwortlich sind. Da das bei FAD verstärkt produzierte, längere Aβ42 als primärer Auslöser der Krankheit angesehen wird, ist ein genaues Verständnis der Produktion längerer Aβ-Spezies von entscheidender Bedeutung, um gegen Aβ gerichtete Wirkstoffe zu entwickeln. Im Rahmen dieser Arbeit wurden spezielle PS1-FAD-Mutationen, wie V261F und L435F, untersucht, die eine stark verringerte Gesamtaktivität und eine beeinträchtigte PS1-Endoproteolyse zur Folge haben. Da sie aber trotz der geringen Aβ-Produktion die Alzheimer-Erkrankung verursachen, stellte sich die Frage, ob wirklich eine veränderte Aβ-Produktion oder eher die Inhibition der Prozessierung anderer γ-Sekretasesubstrate der Auslöser der Krankheit ist. In Zellkulturexperimenten und durch Färbungen von Hirnschnitten von Patienten konnte gezeigt werden, dass diese Mutanten vermehrt toxisches Aβ43 produzieren und so ein stark erhöhtes Aβ42+43/Aβ40-Verhältnis verursachen. Damit erklärt die bisher übersehene, verstärkte Produktion von Aβ43 die Pathogenität der hier untersuchten PS1-Mutanten. Die Produktion längerer Aβ-Spezies durch die FAD-Mutanten wird auf eine verringerte Stabilität des Präsenilin-Aβn-Komplexes und eine damit einhergehende verstärkte Dissoziation der längeren Aβ-Spezies zurückgeführt. Die Ursache dieser Destabilisierung ist jedoch noch nicht bekannt. Um dies genauer zu beleuchten, wurden verschiedene Aβ43 produzierende PS1-Mutanten genauer untersucht, darunter sowohl Mutanten mit normaler als auch mit verringerter Gesamtaktivität. Dabei veränderten alle untersuchten Mutanten die Interaktion zwischen der γ-Sekretase und dem Substrat CTFβ im Bereich um die Schnittstellen der γ-Sekretase. Diese Fehlpositionierung des Substrats deutet auf eine veränderte Konformation des Enzym-Substrat-Komplexes hin, die letztlich zu dessen verringerter Stabilität führen könnte. Da die längeren Aβ-Spezies allgemein als Auslöser der Alzheimer-Erkrankung angesehen werden, ist die Reduktion von Aβ die vorherrschende Behandlungsstrategie, etwa durch Aktivierung des Aβ-Abbaus durch Immunisierung mit anti-Aβ-Antikörpern oder durch Inhibition der Aβ produzierenden β- und γ-Sekretase. Dabei treten jedoch, vor allem im Fall der γ-Sekretaseinhibitoren, starke Nebenwirkungen auf. Eine mögliche Alternative stellen γ-Sekretasemodulatoren (GSMs) dar, da sie die γ-Sekretase nicht inhibieren, sondern die Produktion der verschiedenen Aβ-Spezies in Richtung der kürzeren Formen verschieben, und so weniger Nebenwirkungen verursachen sollten. Anders als zwei zuvor beschriebene GSMs, reduzierte der hier vorgestellte neue GSM RO7019009 die Aβ43-Produktion der untersuchten Mutanten deutlich. Selbiges galt auch für Aβ42, wobei einige Mutationen erst bei deutlich höheren Konzentrationen des Modulators reagierten. Wie erwartet, wurden im Gegenzug vermehrt kürzere Aβ37- und Aβ38-Peptide gebildet. Hierbei zeigten sich, wie schon bei der Aβ42-Reduktion, mutantenspezifische Unterschiede. Manche Mutanten (z.B. V261F und L435F) sekretierten beide kurze Spezies, während andere nur die Aβ38-Produktion erhöhten. Die Produktion der unterschiedlichen Aβ-Spezies in den beiden Aβ-Produktlinien wurde bei verschiedenen PS1-Mutationen also individuell moduliert. Um die Wirksamkeit von GSMs nicht nur in vitro, sondern auch in vivo zu untersuchen, wurden Mäuse, welche die »schwedische« APP-FAD-Mutation exprimieren, über einen Zeitraum von 6 Monaten mit dem GSM RO5506284 behandelt und longitudinal mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) untersucht. Nach Abschluss der Untersuchung wurden die Gehirne der Tiere zusätzlich biochemisch und immunhistochemisch untersucht und die Ergebnisse miteinander verglichen. Dabei zeigte sich, dass der GSM den Anstieg der Amyloidsignale, also das Fortschreiten der Aβ-Pathologie, im Gehirn verringern und die Mengen an abgelagertem Aβ42 reduzieren konnte. Tiere, die zu Beginn der Behandlung schon viel Aβ-Pathologie aufwiesen, reagierten weniger stark auf die Modulation als Tiere mit niedrigen Ausgangswerten, die besser auf die Behandlung ansprachen. Die gesamte Plaquefläche ließ sich durch die Behandlung reduzieren, dabei wurde vor allem die Bildung neuer, kleiner Plaques verhindert, während sich das verbliebene Aβ immer noch an bereits vorhandene Plaques anlagern konnte. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung eines frühen Beginns der Behandlung, möglichst vor oder zu Beginn der Aβ-Pathologie. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass nahezu inaktive PS1-FAD-Mutanten erhöhte Mengen Aβ43 produzieren und so trotz sehr geringer Aβ-Sekretion die Krankheit in Einklang mit der Amyloid-Hypothese auslösen können. Eine der Ursachen für die erhöhte Produktion längerer Aβ-Spezies bei diesen und anderen Aβ43-produzierenden Mutanten könnte die, durch die Mutationen induzierte, Fehlpositionierung des Substrats sein. Im Weiteren konnte gezeigt werden, dass neuere GSMs in vitro und in vivo die Mengen längerer Aβ-Spezies, auch bei PS1-FAD-Mutanten, verringern können und sie daher eine mögliche Therapieoption darstellen.

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia and thus causes enormous problems for patients and society. Since no disease-modifying therapy is available so far, there is need for the development of new, effective and affordable drugs. In order to achieve this, the pathogenesis of AD has to be elucidated in more detail. As familial Alzheimer’s disease (FAD) linked mutations in presenilin-1 (PS1) are the main cause of early onset AD, they are an important tool to understand the detailed pathomechanism. PS1 and its homolog presenilin-2 form the catalytic subunit of the intramembraneprotease complex γ-secretase, which catalyses the final steps of amyloid precursor protein (APP) processing. γ-Secretase cleaves the APP C-terminal fragment (CTFβ) into different amyloid-β (Aβ) species. FAD mutations in PS1 increase the production of longer Aβ42, which is thought to be the main trigger of the disease. Therefore, a better understanding of the molecular consequences of these mutants could help to develop new drugs. In this study, a special type of PS1 FAD mutants (e.g. V261F, L435F) was investigated. These mutants have a strongly reduced total activity and show impaired endoproteolysis. Although the total Aβ levels produced by these mutants are very low, they still cause the disease. This led to the hypothesis that inhibited processing of other γ-secretase substrates, not increased levels of longer Aβ species, is the relevant disease trigger. However, it could be shown that these mutants produce high relative amounts of the neurotoxic and aggregation prone Aβ43. Consistently, brain sections of PS1 L435F mutation carriers presented a drastically increased Aβ43 staining compared to controls. This previously overlooked Aβ43 production leads to increased Aβ42+43/Aβ40 ratios that could cause AD in line with the amyloid hypothesis. These findings contradict the hypothesis of decreased processing of other γ-secretase substrates as disease trigger and support the idea that lowering the levels of long Aβ species is a good approach for successful treatment strategies. In general, the increased production of longer Aβ species by FAD mutants is explained by a decreased stability of the presenilin-Aβn complex, which causes the dissociation of the longer Aβ species before they can be cleaved further. However, the cause of this destabilization remains unknown. By analysing two different sets of Aβ43-producing PS1 FAD mutants, including both normally endoproteolysed and virtually inactive mutants, it could be shown that all these mutants change the binding of the Aβ precursor CTFβ to the active site of the protease. This mispositioning of the substrate indicates a changed conformation of the substrate-enzyme complex, which can be a possible explanation for the decreased complex stability in FAD mutants. As Aβ is widely accepted as primary disease trigger, current therapeutic approaches try to lower Aβ levels either by activation of the Aβ clearance through immunization or by inhibition of the Aβ-producing β- and γ-secretases. The latter approach faces the problem that inhibition γ-secretase led to severe side effects in clinical trials. γ-Secretase modulators (GSMs) are small molecules that shift the Aβ production towards shorter peptides, thereby reducing the amount of toxic Aβ42/43. However, they do not alter the total γ-secretase activity. The new GSM RO7019009, which was tested in this study, efficiently reduced Aβ43 production for all investigated mutants. Aβ42 production was reduced in these mutants as well, although some of them only responded at higher GSM concentrations. Consequently, the production of Aβ38 was increased upon RO7019009 treatment for all the mutants, while only some mutants (e.g. V261F, L435F) increased the production of both short species Aβ37 and Aβ38. These findings indicate that RO7019009 acts differently on both Aβ product lines depending on the individual PS1 mutant. In an additional part of the study, GSM function was assessed in vivo. Transgenic mice, expressing the »swedish« APP FAD mutant, were treated for 6 months with the GSM RO5506284. During the experiment, amyloid levels were monitored longitudinally by positron emission tomography (PET). After the treatment, the mouse brains were analysed biochemically and immunohistochemically in order to be compared with the PET-measurements. The amyloid levels measured by PET increased significantly slower in the treated animals compared to the control group. RO5506284 treatment reduced the amount of deposited Aβ42 in the brain. In addition, the amyloid plaque area was smaller in GSM-treated animals, which showed lesser smaller plaques and more large ones. This indicates that the reduction of Aβ by the GSM was strong enough to inhibit plaque formation; however, the remaining Aβ still was able to attach to already formed plaques. Interestingly, amyloid levels at the beginning of the treatment predicted its efficiency. Animals with high initial amyloid levels were less reactive towards the GSM, while animals with low starting amyloid levels responded well. These results underline the importance of an early treatment since GSM treatments seem to be more effective when there is no or only little plaque pathology present. Taken together, this thesis shows that virtually inactive PS1 FAD mutations secrete high relative amounts of the neurotoxic Aβ43, which could be responsible for the pathogenicity of these mutations. These and other Aβ43-producing mutations cause a mispositioning of the substrate that could contribute to the increased production of longer Aβ species by FAD mutants. In addition, the investigated GSMs were able to decrease these longer Aβ species in vitro and in vivo and could therefore be a promising therapeutic approach for AD.