Force and affinity in cellulosomal complexes

Durner, Ellis (2019): Force and affinity in cellulosomal complexes. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

In dieser Arbeit werden die molekularen Mechanismen der Organisation des Cellulosoms - ein komplexes extrazelluläres Proteinnetzwerk - als Modellsystem für Protein-Protein Interaktionen mittels biophysikalischer Methoden untersucht. Dieses extrazelluläre Organell ermöglicht bestimmten Bakterien die Zersetzung von Cellulose, indem es Enzyme und Cellulose-Bindedomänen auf gerüstartigen Proteinstrukturen in synergistischer Weise kombiniert. Die einzelnen Komponenten werden hierbei von einer Klasse von Rezeptor-Liganden-Paaren namens Cohesin- Dockerin in ihrer Stöchiometrie und Anordnung funktionell kombiniert. Ein Teil dieser Arbeit besteht in der Entschlüsselung der molekularen Bindemechanismen des Cohesins CohE, welches das Bakterium Ruminococcus flavefaciens mit seinem Cellusom verbindet. Durch die Kombination von Einzelmolekül-Kraftspektroskopie mit Molekulardynamik-Simulationen konnte die aussergewöhnliche Belastbarkeit der Interaktionen von CohE mit zwei homologen Dockerinen entschlüsselt werden. Hierbei wurde insbesondere der Einfluss der Kraftpropagation innerhalb eines Proteinkomplexes auf dessen mechanische Widerstandsfähigkeit untersucht. Die physiologische Verankerung über den carboxyl-Terminus von CohE erwies sich als deutlich robuster im Vergleich zu einer nicht nativen N-terminalen Verankerung. Um den Kontrast zwischen hoher mechanischer Belastbarkeit bei moderaten Affinitäten im nano- bis mikromolaren Bereich besser verstehen zu können, wandte ich mich der Bestimmung der kinetischen Ratenkonstanten koff und kon zu, deren Quotient die Gleichgewichtskonstante bildet. Während es eine kleine Dissoziationskonstante dem Bakterium ermöglichen würde die von ihm exprimierte Nanomaschinerie fest an sich zu binden, könnte ein höheres koff und kon einen dynamischeren Austausch von Cellulosomen innerhalb des Mikrobioms ermöglichen. Zusätzlich stellte sich die Frage, ob die Verankerungsgeometrie auch in Abwesenheit von Kraft Einfluss auf das Bindeverhalten nehmen würde. Nachdem initiale Messungen mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie inkonsistent waren, wurde eine neuartige, enzymbasierte Kopplungsstrategie für oberflächengebundene Affinitätsbestimmungen entwickelt. Hiermit konnte CohE funktional und spezifisch auf Sensoroberflächen immobilisiert werden. Es zeigte sich, dass in Abwesenheit von externer Kraft die Verankerungsgeometrie von CohE keinen Einfluss auf das Bindeverhalten hat. Dies bestärkt im Umkehrschluss die Hypothese, dass mechanische Stabilitäten stets geometrieabhängig zu untersuchen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auch methodische Verbesserungen in der Einzelmolekülkraftspektroskopie erzielt. Zum einen wurde eine Strategie entwickelt, um Proteindomänen zeitsparend in vitro zu exprimieren und ohne weitere Aufreinigung spezifisch auf Objektträgern zu verankern. Die darauffolgende enzymatische Peptidligation eines Dockerins via Sortase A erlaubt es nun, mit hohem Durchsatz Entfaltungsstudien an Proteinen mithilfe der Cohesin-Dockerin Interaktion durchzuführen. Weiterhin ermöglichte es dieselbe Sortase-vermittelte Peptidligation, die gängigen Polyethylenlinker durch Elastin-ähnliche Peptide zu ersetzen. Dies verhindert Artefakte, die sonst durch Polyethylenlinker bei Protein-Kraftspektroskopie über 100 pN entstünden. Zuletzt wurde der Entfaltungsprozess einer Cohesin-Domäne aus Acetivibrio cellulolyticus untersucht, deren Familie in vorangegangenen Studien teils bimodale Entfaltungskraftverteilungen zeigte. Durch die Kombination zweier Messmodi konnte die Kraft-Ladungsrate über fünf Größenordnungen variiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass das dabei beobachtete Verhalten mit einer Konformationsänderung während der experimentellen Zeitskala zwischen verschiedenen, gefalteten Konformationen konsistent ist.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 19. Dezember 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Gaub, Hermann