Deletion of a conserved cis-regulatory element exacerbates atherosclerosis via upregulation of Hdac9 in myeloid cells

Yan, Guangyao (2020): Deletion of a conserved cis-regulatory element exacerbates atherosclerosis via upregulation of Hdac9 in myeloid cells. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Previous results from genome-wide association studies (GWAS) showed that the strongest risk locus rs2107595 was associated with atherosclerotic stroke. This single nucleotide polymorphism (SNP) was shown to regulate HDAC9 in a gene-dosage effect. Furthermore, Hdac9 knockout attenuated atherogenesis in both Apoe−/− and Ldlr−/− mouse models, underscoring the atherogenic effect of HDAC9. However, the direct causative role of the risk locus rs2107595 in atherogenesis was not established. Since rs2107595 is not conserved in the mouse genome, the highly conserved intergenic region encompassing the SNP was exploited to study the role of rs2107595 during atherogenesis. Therefore, this is the first study to show a direct causative role of the cis-regulatory element (CRE) containing rs2107595 in atherosclerotic development. In this study, a novel mouse model, the Hdac9ΔCis−/− mouse, was generated via deleting the highly conserved CRE (around 1.1 kb) encompassing the SNP. Interestingly, Hdac9ΔCis−/− mice displayed an upregulation of HDAC9 in myeloid cells, especially in pro-inflammatory macrophages, representing an expression pattern mimicking human risk allele A carriers. After cross-breeding Hdac9ΔCis−/− mice into the atheroprone Apoe−/− mouse model, Apoe−/− Hdac9ΔCis−/− were generated, which developed significantly larger atherosclerotic plaques. Chemokine and cytokine profiles showed that Apoe−/− Hdac9ΔCis−/− mice developed a pro-inflammatory milieu with a prominent upregulation of IL-1β, IL-6 and IL-18 in the plasma, indicating an enhanced NLRP3 inflammasome activation. Flow cytometric analysis revealed the enrichment of pro-inflammatory cell types (i.e. neutrophils, classical monocytes), further confirming the pro-inflammatory contribution of myeloid cells from Apoe−/− Hdac9ΔCis−/− mice. Bone marrow transplantation (BMT) experiments further confirmed the atherogenic role of Apoe−/− Hdac9ΔCis−/− myeloid cells. To explore the potential role of HDAC9 in NLRP3 inflammasome activation, Apoe−/− Hdac9ΔCis−/− bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were studied and showed elevated cleavage of pro-caspase-1 compared to Apoe−/− BMDMs. Loss-of-function experiments in BMDMs further confirmed the role of HDAC9 in Pro-caspase-1 cleavage. Furthermore, co-immunoprecipitation results revealed a potential physical interaction between HDAC9 and NLRP3. Taken together, knocking out the highly conserved cis-regulatory element of Hdac9 exacerbated atherosclerosis via an upregulation of HDAC9 specifically in myeloid cells. Moreover, preliminary results indicated a potential role of HDAC9 in NLRP3 inflammasome activation.

Abstract

Frühere Ergebnisse aus genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) zeigten, dass der stärkste Risikolokus rs2107595 mit dem atherosklerotischen Schlaganfall assoziiert ist. Dieser Einzelnukleotid-Polymorphismus (engl. Single Nucleotide Polymorphism: SNP) reguliert nachweislich HDAC9 in einer Gen-Dosis-abhängigen Weise. Darüber hinaus kommt es durch den Hdac9-Knockout zu einer verminderten Atherogenese; sowohl in Apoe−/− als auch in Ldlr−/− Mausmodellen, was die atherogene Wirkung von HDAC9 unterstreicht. Die direkte ursächliche Rolle des Risikolokus rs2107595 in der Atherogenese konnte jedoch nicht festgestellt werden. Da rs2107595 im Mausgenom nicht konserviert ist, wurde die hochkonservierte intergenische Region, die den SNP umfasst, ausgenutzt, um die Rolle von rs2107595 während der Atherogenese zu untersuchen. Daher ist dies die erste Studie, die eine direkte ursächliche Rolle des cis-regulierenden Elements (CRE), welches rs2107595 beinhaltet, bei der atherosklerotischen Pathogenese zeigt. In dieser Studie wurde ein neuartiges Mausmodell, die Hdac9ΔCis−/− Maus, durch die Deletion des hochkonservierten CRE (ca. 1,1 kb), welches den SNP umfasst, generiert. Interessanterweise zeigten Hdac9ΔCis−/− Mäuse eine Hochregulation von HDAC9 in myeloischen Zellen, insbesondere in pro-inflammatorischen Makrophagen, welche ein Expressionsmuster darstellten, das das der menschlichen Risiko-Allel-Träger nachahmt. Durch die Einkreuzung von Hdac9ΔCis−/− Mäusen in das atheroprone Apoe−/− Mausmodell wurden Apoe−/− Hdac9ΔCis−/− Mäuse generiert, die dadurch signifikant größere atherosklerotische Plaques entwickelten. Eine Untersuchung der Chemokin- und Zytokinprofile zeigte, dass die Apoe−/− Hdac9ΔCis−/− Mäuse ein pro-inflammatorisches Milieu mit einer prominenten Hochregulierung von IL-1β, IL-6 und IL-18 im Plasma entwickelten, was auf eine verstärkte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms hinweist. Durchflusszytometrische Analysen ergaben eine Anreicherung pro-inflammatorischer Zelltypen (d.h. Neutrophile, klassische Monozyten), was die pro-inflammatorische Beteiligung der myeloischen Zellen von Apoe−/− Hdac9ΔCis−/− Mäusen weiter bekräftigte. Knochenmark-Transplantationsexperimente (engl. bone marrow transplantation: BMT) bestätigten des Weiteren die atherogene Rolle der myeloischen Zellen in Apoe−/− Hdac9ΔCis−/− Mäusen. Zur Untersuchung der potenziellen Rolle von HDAC9 bei der Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms wurden isolierte Makrophagen aus dem Knochenmark von Apoe−/− Hdac9ΔCis−/− Mäusen untersucht (engl. bone marrow-derived macrophages: BMDMs), die im Vergleich zu BMDMs von Apoe−/− Mäusen eine erhöhte Spaltung von Pro-Caspase-1 zeigten. Funktionsverlust-Experimente in BMDMs bestätigten zudem die Rolle von HDAC9 bei der Spaltung von Pro-Caspase-1. Darüber hinaus konnte mit Hilfe von Koimmunpräzipitationsexperimenten eine mögliche physikalische Interaktion zwischen HDAC9 und NLRP3 nachgewiesen werden. Zusammenfassend lässt sich daraus schließen, dass die Ausschaltung des hochkonservierten cis-Regulationselements von Hdac9 die Atherosklerose durch eine Hochregulierung von HDAC9 speziell in myeloischen Zellen verstärkt. Darüber hinaus weisen erste Ergebnisse auf eine mögliche direkte Rolle von HDAC9 bei der Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms hin.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: HDAC9, Atherosclerosis, GWAS, Inflammation
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 31. August 2020
• 1. Bericht­erstatter:in: Bernhagen, Jürgen