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Einfluss von Zigarettenrauch auf Komposition und Aktivität des Proteasoms in humanen PBMCs
Einfluss von Zigarettenrauch auf Komposition und Aktivität des Proteasoms in humanen PBMCs
Tabakkonsum und dessen Folgeerkrankungen sind weltweit für 6 Millionen Todesfälle jährlich verantwortlich. In mehreren vorhergehenden Studien wurde bereits ein Effekt von Zigarettenrauch auf Proteasomen in unterschiedlichen Zellen des Lungengewebes nachgewiesen. Proteasomen waren weniger aktiv, was zu einer Akkumulation oxidativ veränderter Proteine sowie veränderter MHC I-Antigenpräsentation führte (Kammerl et al., 2016; van Rijt et al., 2012). Auch in Lungenzellen von COPD-Patienten wurde bereits eine verminderte proteasomale Aktivität nachgewiesen (Kammerl et al., 2016). Somit können die proteasomale Aktivität und Expression potenziell als neue Biomarker für Früherkennung oder Verlauf von COPD-Erkrankungen in Betracht gezogen werden. Ziel dieser Studie war es, die Regulation des Proteasoms als Reaktion auf Zigarettenrauch in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) bei gesunden Rauchern zu untersuchen, um nachzuweisen, ob bereits bei gesunden rauchenden Probanden ohne Krankheitsmanifestation Veränderungen in der proteasomalen Expression oder Aktivität festzustellen sind. Mittels Durchflusszytometrie wurde die Zellzusammensetzung des Blutes ermittelt und die Vergleichbarkeit der Probanden gewährleistet. Raucher wurden mit Hilfe eines Cotinin-Elisas als solche verifiziert. Anschließend wurden PBMCs aus dem Blut von 20 Rauchern und 20 Nichtrauchern isoliert und mittels RT-qPCR und Massenspektrometrie hinsichtlich ihrer proteasomalen Expression auf Transkript- und Proteinebene verglichen. Außerdem wurde mit Hilfe von activity-based-probes und Aktivitätsanalysen im Nativgel die Aktivität der verschiedenen Proteasomkomplexe in Blutzellen bestimmt. Es zeigte sich eine auf Proteinebene erhöhte Abundanz der Immuno-Untereinheit β1i bei Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern, die jedoch nicht zu einer erhöhten immunoproteasomalen Aktivität beitrug. Die Gesamtaktivität des Proteasoms im Blut von Rauchern war nicht signifikant verändert gegenüber Nichtrauchern, es konnte jedoch eine Aktivitätsverschiebung bei Rauchern von 20S- hin zum 26S-Proteasom nachgewiesen werden. Während die Menge des assemblierten 26S-Proteasoms in PBMCs von Rauchern signifikant reduziert war, zeigten Raucher eine erhöhte relative Aktivität des 26S-Proteasoms. Dies deutet auf eine verminderte Assemblierung des 26S-Proteasoms in Blutzellen junger gesunder Raucher hin, obwohl die Proteinmenge zahlreicher 19S-Regulatoruntereinheiten signifikant erhöht war. Die vorliegenden Daten zeigen, dass die Bestimmung der Expression und Aktivität des Proteasoms in Blutzellen ein möglicher Ansatz für eine Biomarkeranalyse ist. Trotz einer kleinen Stichprobenauswahl von nur 20 Probanden pro Gruppe konnten Unterschiede zwischen Rauchern und Nichtrauchern detektiert werden. Derzeit werden Methoden entwickelt, die darauf abzielen, die proteasomale Aktivität größerer Kohorten verlässlich zu analysieren (de Bruin et al., 2016). Differentielle Proteasomenaktivitäten in PBMCs könnten einerseits zur Identifikation von Risikopatienten und zur Krankheitsfrüherkennung dienen. Andererseits könnten veränderte proteasomale Eigenschaften als Angriffspunkt für neue Therapieansätze dienen.
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Peierl, Julia
2020
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Peierl, Julia (2020): Einfluss von Zigarettenrauch auf Komposition und Aktivität des Proteasoms in humanen PBMCs. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Tabakkonsum und dessen Folgeerkrankungen sind weltweit für 6 Millionen Todesfälle jährlich verantwortlich. In mehreren vorhergehenden Studien wurde bereits ein Effekt von Zigarettenrauch auf Proteasomen in unterschiedlichen Zellen des Lungengewebes nachgewiesen. Proteasomen waren weniger aktiv, was zu einer Akkumulation oxidativ veränderter Proteine sowie veränderter MHC I-Antigenpräsentation führte (Kammerl et al., 2016; van Rijt et al., 2012). Auch in Lungenzellen von COPD-Patienten wurde bereits eine verminderte proteasomale Aktivität nachgewiesen (Kammerl et al., 2016). Somit können die proteasomale Aktivität und Expression potenziell als neue Biomarker für Früherkennung oder Verlauf von COPD-Erkrankungen in Betracht gezogen werden. Ziel dieser Studie war es, die Regulation des Proteasoms als Reaktion auf Zigarettenrauch in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) bei gesunden Rauchern zu untersuchen, um nachzuweisen, ob bereits bei gesunden rauchenden Probanden ohne Krankheitsmanifestation Veränderungen in der proteasomalen Expression oder Aktivität festzustellen sind. Mittels Durchflusszytometrie wurde die Zellzusammensetzung des Blutes ermittelt und die Vergleichbarkeit der Probanden gewährleistet. Raucher wurden mit Hilfe eines Cotinin-Elisas als solche verifiziert. Anschließend wurden PBMCs aus dem Blut von 20 Rauchern und 20 Nichtrauchern isoliert und mittels RT-qPCR und Massenspektrometrie hinsichtlich ihrer proteasomalen Expression auf Transkript- und Proteinebene verglichen. Außerdem wurde mit Hilfe von activity-based-probes und Aktivitätsanalysen im Nativgel die Aktivität der verschiedenen Proteasomkomplexe in Blutzellen bestimmt. Es zeigte sich eine auf Proteinebene erhöhte Abundanz der Immuno-Untereinheit β1i bei Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern, die jedoch nicht zu einer erhöhten immunoproteasomalen Aktivität beitrug. Die Gesamtaktivität des Proteasoms im Blut von Rauchern war nicht signifikant verändert gegenüber Nichtrauchern, es konnte jedoch eine Aktivitätsverschiebung bei Rauchern von 20S- hin zum 26S-Proteasom nachgewiesen werden. Während die Menge des assemblierten 26S-Proteasoms in PBMCs von Rauchern signifikant reduziert war, zeigten Raucher eine erhöhte relative Aktivität des 26S-Proteasoms. Dies deutet auf eine verminderte Assemblierung des 26S-Proteasoms in Blutzellen junger gesunder Raucher hin, obwohl die Proteinmenge zahlreicher 19S-Regulatoruntereinheiten signifikant erhöht war. Die vorliegenden Daten zeigen, dass die Bestimmung der Expression und Aktivität des Proteasoms in Blutzellen ein möglicher Ansatz für eine Biomarkeranalyse ist. Trotz einer kleinen Stichprobenauswahl von nur 20 Probanden pro Gruppe konnten Unterschiede zwischen Rauchern und Nichtrauchern detektiert werden. Derzeit werden Methoden entwickelt, die darauf abzielen, die proteasomale Aktivität größerer Kohorten verlässlich zu analysieren (de Bruin et al., 2016). Differentielle Proteasomenaktivitäten in PBMCs könnten einerseits zur Identifikation von Risikopatienten und zur Krankheitsfrüherkennung dienen. Andererseits könnten veränderte proteasomale Eigenschaften als Angriffspunkt für neue Therapieansätze dienen.