The impact of bacterial signaling molecules on the alveolar immunity of the lung

Prungnaud, Raphaël (2020): The impact of bacterial signaling molecules on the alveolar immunity of the lung. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Mammalian lungs have evolved with the environment as organs with the largest interface to the outside world. Our lungs exist in a state of homeostasis despite their consistent exposition to thousands of exogenous chemicals, particles and microorganisms carried by the air. As previously described for the gut and the skin, a high diversity of microbes lives and prospers in interaction with their host on the pulmonary surface as well, thereby connecting us to the environment. However, imbalances between beneficial and pathogenic microbes in this complex biological system can cause acute or chronic diseases. From these empirical observations, the human microbiome, in its diversity, interacts actively with the host immunity. This project aims to investigate the effect of two classes of bacterial signaling molecules on the inflammation dynamics of the lung, focusing on differentiation of T helper (Th) cells, activation (polarization) of alveolar macrophages (AM), and wound healing and repair during an inflammatory response. On one hand, the quorum sensing (QS) molecule 3-oxo-C12-HSL (AHL), produced by the pathogenic bacterium Pseudomonas aeruginosa (PAO1 strain) and on the other hand the D-tryptophan (D-Trp), amino acid secreted by probiotic lactic acid bacteria, like Lactobacillus casei, were studied as examples of two classes of molecules involved in having a potential therapeutic interaction with the host. First the effects of the 3-oxo-C12-HSL on murine Th cells, especially Th17 and Th2-cell differentiation, were investigated. 3-oxo-C12-HSL increased interleukin 17 (IL-17) production of Th17 cells. However, it did not influence interleukin 4 (IL-4) production in Th2 differentiated cells. IL-17, mainly produced from Th17 cells, is a pro-inflammatory cytokine responsible for the chemoattraction of leukocytes to the site of inflammation; whereas IL-4, produced from Th2 cells and a key regulator of adaptive immunity, is also involved in M2-polarization of macrophages, thereby promoting the resolution of inflammation and wound repair. Altogether these results showed that 3-oxo-C12-HSL stimulation of differentiated Th17 cells supported IL-17 production and might thereby promote the inflammatory response. During a bacterial lung infection, the primary immune response is conducted by tissue resident, alveolar macrophages (AM). To study the effect of AHLs on alveolar macrophage polarization, M0-naïve AM (MH-S cell line) were polarized with lipopolysaccharide (LPS) towards M1-polarization and simultaneously treated with AHLs (60 μM). Interestingly, both the expression and secretion of the pro-inflammatory cytokines Tumor Necrosis Factor α (TNFα) and Interleukin 1 beta (IL-1β) rose by the cotreatment with AHLs, mostly 3-oxo-C12-HSL, suggesting that the development of M1 AM and thus an inflammatory response was supported. D-Trp treatment (10-100 μM), simultaneous applied to M1-polarization, led also to an increase of TNFα secretion, suggesting that D-Trp contributed to a pro-inflammatory modulation of the AM as well. Then again, both 3-oxo-C12-HSL and D-Trp treatments supported alternative, IL-4 triggered AM polarization (M2-polarization), characterized by increased expression of the markers Arginase 1 (Arg1) and Mannose Receptor C-Type 1 (Mrc1). The latter results suggest that M2-polarization could be enhanced by 3-oxo-C12-HSL and D-Trp, thereby eventually promoting M2 dependent repair pathways during the resolution phase of inflammation. In aim to test the influence on repair pathways, a lung epithelium coculture model, consisting of AM (MH-S) and alveolar epithelial cells type 2 (AECII; LA-4 and MLE-12 cell lines) was investigated. The coculture wound healing assays however revealed that 3-oxo-C12-HSL, and D-Trp to a lesser extent, inhibited in vitro epithelial barrier function and healing independently even from a by LPS induced inflammatory response. Similarly, Pseudomonas aeruginosa’s culture supernatant, containing secreted AHL, greatly impaired epithelial wound healing. Also in vivo, in an acute lung injury (ALI) model, created by intratracheal LPS delivery into the lung of BALB/c mice, therapeutically treatment with 3-oxo-C12-HSL, at a dose of 1200 μM (corresponding to a local strong PAO1 infection) failed to reduce polymorphonuclear neutrophil (PMN) recruitment in the airspace of the lung after acute lung injury. This altogether rejects the hypothesis of therapeutic effects of AHL during inflammatory conditions of the lung. In contrast, D-Trp treatment reduced PMN recruitment in the ALI model, accompanied by a trend in declined bronchoalveolar lavage (BAL) levels of the chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (CXCL1), while L-Trp had no comparable effect. mRNA analysis of the whole lung homogenate confirmed that the expression of CD11b (a marker for PMNs and inflammatory macrophages) was mildly reduced after D-Trp instillation. These results collectively confirmed the anti-inflammatory effects of D-Trp in an injured lung. Since D-Trp can have transcriptional signaling activity via the aryl hydrocarbon receptor (AhR), whose immunological importance is gaining more and more attention, the involvement of this pathway was investigated in bone marrow derived macrophages (BMDM) from AhR-/- (AhRtm1Bra) mice. D-Trp treatment of BMDM caused an AhR dependent expression of the prototypic AhR target gene cytochrome P450-1A1 (Cyp1a1) and also indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (Ido1), while L-Trp had no effect. Since Ido1 metabolizes tryptophan to kynurenine, which in turn is sensed by AhR, this suggests a positive feedback loop. Finally, D-Trp but not L-Trp treatment of BMDM also reduced the expression of the LPS stimulated M1 markers interleukin-6 (Il-6) and Nos2, and enhanced the by IL-4 stimulated M2 markers Arg1 and Mrc1, all in an AhR dependent manner. In summary, the results suggest not the investigated AHL 3-oxo-C12-HSL, but rather D-tryptophan as a potential target of respiratory medicine, due to its receptor specific immunomodulatory, anti-inflammatory role on macrophages and alveolar macrophages, which might be used to alleviate pulmonary inflammation or support its resolution.

Abstract

Die Lungen von Säugetieren haben sich ihrer Umwelt angepasst. Dabei haben sie die größte Oberfläche im menschlichen Körper entwickelt, die mit der Außenwelt in Kontakt ist. Unsere Lunge existiert dabei in innerer Homöostase trotz ständiger Exposition von tausenden exogener Chemikalien, Partikeln und Mikroorganismen in der Atemluft. Wie bereits für den Darm und die Haut beschrieben, lebt auch auf der Lungenepitheloberfläche eine hohe Diversität von Mikroorgansimen in Interaktion mit ihrem Wirt und ist damit ein Bindeglied zwischen unserer Lunge und der Außenwelt. Allerdings können Ungleichgewichte zwischen gutartigen und pathogenen Mikroben dieses komplexe biologische System zu akuten als auch chronischen Erkrankungen verändern. Durch empirische Untersuchungen wurde festgestellt, dass das humane Mikrobiom in seiner Diversität aktiv mit dem Immunsystem des Wirts interagiert. Dieses Projekt hatte als Ziel, die Effekte von zwei bakteriellen Signalmolekülen auf die Entzündungsdynamik der Mäuselunge zu untersuchen. Dabei wurde auf folgende Funktionen fokussiert: die Differenzierung von T-Helfer-Zellen (Th), die Differenzierung von Alveolarmakrophagen, und die Wundheilung während einer Entzündungsantwort. Einerseits waren es Quorum sensing-Signalstoffe vom N-Acyl-homoserinlacton (AHL)-Typ (w.z.B. 3-oxo-C12-HSL) des Gram-negativen pathogenen Bakteriums Pseudomonas aeruginosa (PAO1-Stamm), sowie andererseits D-tryptophan (D-Trp), welches vom Gram-positiven probiotischen Bakterium Lactobacillus casei gebildet wird. Beiden werden potenziell therapeutische Wechselwirkungen mit dem Immunsystem des Wirts zugeschrieben. Zunächst wurden die Effekte verschiedener AHL-Strukturen auf die Differenzierung von T-Helferzellen (Th), besonders im Bezug auf die Th17- und Th2-Zelldifferenzierung, untersucht. 3-oxo-C12-HSL induzierte eine erhöhte Interleukin 17 (IL-17) Produktion in Th17 Zellen, während 3-oxo-C4-HSL und C12-HSL keine Stimulierung zeigten. Im Gegensatz konnte 3-oxo-C12-HSL die Interleukin 4 (IL-4) Produktion der Th2 Zellen nicht induzieren. IL-17, hauptsächlich produziert von Th-17 Zellen, ist ein entzündungsförderndes Zytokin, welches für die Zytokin-getriebene Anlockung von Immunzellen in Richtung der Entzündung verantwortlich ist. Auf der anderen Seite steht IL-4, welches von Th2-Zellen produziert wird, und eine Schlüsselfunktion in der Regulation der adaptiven Immunantwort hat. IL-4 ist verantwortlich für die Rekrutierung von M2-Makrophagen, welche wiederum die Entzündung herunterregulieren und dabei zur Wundheilung beitragen. Zusammen zeigen die Ergebnisse für AHL, dass 3-oxo-C12-HSL durch die erhöhte Stimulation der IL-17 Produktion zur Entzündungsreaktion beitragen kann. Die primäre Immunantwort während einer bakteriellen Entzündung wird durch gewebespezifische alveolare Makrophagen (AM) ausgeführt. Um den Effekt von AHL auf AM zu untersuchen, wurden zunächst M0-naive AM (MH-S Zelllinie) durch Lipopolysaccharid (LPS) zu M1-Makrophagen (M1-AM) stimuliert und simultan mit AHLs behandelt (60 μM). Interessanterweise wurde die Expression und Sekretion der Zytokine Tumornekrose-Faktor α (TNFα) und IL-1β erhöht durch vor allem 3-oxo-C12-HSL. Dies weist darauf hin, dass AHLs eine Rolle in der Verstärkung M1-AM Immunantwort spielen. Zusätzlich induzierte auch D-Trp eine gesteigerte TNFα Sekretion; dies deutet ebenfalls auf eine Rolle von D-Trp in der Verstärkung der entzündlichen Immunantwort durch M1-AM hin. Auf der anderen Seite induzierten sowohl 3-oxo-C12-HSL als auch D-Trp die alternative AM Polarisierung (M2-Polarisierung), welche durch die Expression der M2-Marker Arginase 1 (Arg1) und Mannose-Rezeptor C-Typ 1 (Mrc1) gekennzeichnet war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die M2-Polarisierung durch AHL und D-Trp verstärkt wird und dass 3-oxo-C12-HSL und D-Trp dadurch eventuell M2-abhängige Reparaturmechanismen während der Entzündungsauflösung vorantreiben. Um den Einfluss auf Reparaturmechanismen zu untersuchen, wurde ein Ko-Kultursystem verwendet, welches aus alveolaren Typ-2 Zellen (AECII; LA-4 und MLE-12 Zelllinien) und AM (MH-S) bestand. Die Behandlung der Ko-Kultur aus AECII und AM mit AHL führte zur Reduktion von TNFα, IL1β und Nitric-Oxide Synthase 2 (Nos2), die als M1 Entzündungsmarker gelten. Zusätzlich wurde die Expression des M2-charakterisierenden Gens Arg1 erhöht. Auf der anderen Seite blockierten sowohl 3-oxo-C12-HSL als auch D-Trp, obwohl letzteres zu einem geringeren Grad, die in vitro Wundheilung der Epithelzellen. Diese Ergebnisse waren unabhängig von der Stimulation durch LPS. Des Weiteren wurde ein in vivo Modell für akute Lungenschädigung (ALI) etabliert, bei dem die Lungen von BALB/c Mäusen mit LPS behandelt wurden. Die Behandlung mit AHL (1200 μM, äquivalent zu einer starken lokalen PAO1 Infektion) konnte die Rekrutierung/Anzahl an polymorphonuklearen Neutrophilen (PMN) in den Atemwegen nicht reduzieren. Allerdings gelang dies durch Behandlung mit D-Trp. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit D-Trp die Produktion des Chemokin (C-X-C motiv) Liganden 1 CXCL1 in der BAL reduzierte. Die Analyse der mRNA der gesamten Lunge ergab eine Reduktion des PMN-Markers CD11b. Diese Resultate unterstreichen die entzündungshemmende Wirkung von D-Trp in Lungenschädigungen. D-Trp ist auch bekannt als Agonist des Aryl-Hydrocarbon-Rezeptors (AhR). Die Bindung von D-Trp an AhR führt zur Translokation von AhR in den Zellnukleus. Zahlreiche Mechanismen sind beschrieben, die nach Aktivierung von AhR initiiert werden. Darunter befindet sich das Enzym Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1 (IDO1), welches D-Trp zu Kynurenine katabolisiert, sowie das Zytochrom P4501-1A (CYP1A1), welches in den xenobiotischen Metabolismus involviert ist. Expressionsanalysen in aus Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDM) von AhR+/- und AhR-/- Mäusen (AhRtm1Bra) zeigten, dass die Expression von IDO1 und CYP1A1 von D-Trp abhängig waren (100 μM) sowie von der Anwesenheit von AhR, nicht jedoch von der Anwesenheit von L-Trp. Um die Funktion von AhR in der Immunantwort der Lunge zu untersuchen, wurden die Expression von IL 6 und Arg1 in AhR-/- BMDM-Mäusen untersucht. Die zuvor gezeigte entzündungshemmende Wirkung von D-Trp war auch in den AhR-/- Zellen präsent. Die mRNA Expression von AhR wurde durch D-Trp verstärkt. Dies läßt eine von D-Trp oder dessen Metaboliten abhängige Rückkopplungsschleife vermuten. Die gesteigerte metabolische Aktivität von D-Trp ist konsistent mit der Regulation der Immunantwort durch Entzündungs-stimulierte AM. Daher trägt D-Trp potenziell zu einer verstärkten oder schnelleren Auflösung der Immunantwort bei. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass nicht AHL, sondern eher D-Trp ein potentielles Therapeutikum in der Atemwegsmedizin werden könnte. Durch seine rezeptorspezifischen, immunmodulatorischen und entzündungshemmenden Funktionen in Makrophagen sowie auch in alveolaren Makrophagen könnte D-Trp zu einer Verminderung der Entzündung in der Lunge beitragen bzw. die Auflösung der Entzündung unterstützen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 23. Juni 2020
• 1. Bericht­erstatter:in: Hartmann, Anton