Entwicklung neuer Diagnostikmethoden für genetische Erkrankungen basierend auf der Click-Chemie

Raddaoui, Nada (2019): Entwicklung neuer Diagnostikmethoden für genetische Erkrankungen basierend auf der Click-Chemie. Dissertation, LMU München: Fakultät für Chemie und Pharmazie

Abstract

Jede Krankheit kann man vermutlich auf eine genetische Störung zurückführen. Die Methoden u. a. zur Detektion von Chromosomenaberrationen sind daher von großer Bedeutung für Diagnostik und Therapiezwecke. Heutzutage beruht die Diagnostik von genetischen Krankheiten auf der Detektion des entsprechenden defekten Gens oder auf der Messung entweder des jeweiligen Transkripts durch die quantitative „real-time-Polymerase Chain Reaction“ (RT-qPCR)oder des jeweiligen Proteins via z.B. Massenspektrometrie. Auch die Durchflusszytometrie wird als Standardmethode verwendet, um für Krebszellen spezifische Oberflächenproteine zu detektieren und zu quantifizieren. Vor allem wird sie für die Analyse des Zellzyklus bei der Diagnose benutzt. Ein Vorteil der Methode ist die gleichzeitige Analyse einer großen Anzahl von Zellen (z.B. Blutzellen). Eine Abweichung in der Zellproliferationsrate oder eine Anomalität in der Zellvermehrung deuten auf eine genetische Mutation hin. Obwohl diese Methoden gut etabliert sind und in fast jedem Diagnostiklabor verwendet werden, bleiben sie indirekte Nachweismethoden. Direkte Informationen bekommt man mit der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung FISH, die es ermöglicht, die betreffenden Gene in situ sichtbar zu machen. Hiermit wird ein Ziel-Gen mit einer fluoreszierenden Sonde markiert und in seinem ursprünglichen Platz in der Zelle mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie detektiert. Wichtige Informationen, die durch das Aufschließen der Zellen und das Isolieren der DNA oder RNA verloren gehen können, bleiben mit der FISH erhalten. Sie ermöglicht es, Informationen auf der Ebene einzelner Zellen zu gewinnen. Außerdem kann die Expressionsaktivität von einer Zelle zur andern unterschieden werden. Expressionsaktive Zellen werden von den expressionsstillen differenziert. Die Detektionsgrenze erkrankter Zellen ist ein ernstes Problem, denn Krebspatienten müssen trotz erster Erfolgszeichen nach der Therapie wiederholt und regelmäßig medizinisch kontrolliert werden. Erst nach fünf Jahren ohne Rückfall der Krankheit (Remission) können die behandelnden Ärzte und die betroffenen Patienten von Therapieerfolg sprechen. Trotz der Entwicklung sowohl neuer Farbstoffe als auch unzähliger neuer Methoden für die Fluoreszenzmikroskopie, die ein verbessertes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis anbieten, ist die Detektionsgrenze weiterhin der limitierende Faktor. Diese Methoden beruhen auf der Herstellung von Sonden, die willkürlich mit Farbstoffen versehen werden. Die ungenaue limitierte Markierung in einer uneinheitlichen Sondenherstellung führt zu unterschiedlichen Ergebnissen. In dieser Arbeit wurde die in der Gruppe von Thomas Carell für Nukleinsäuren entwickelte Cu(I)-katalysierte Alkin-Azid-Cykloaddition (CuAAC) benutzt, um neue mit fluoreszenten Farbstoffen markierten Sonden zu entwickeln, die eine bessere Sensitivität und ein niedrigeres Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis bieten.

Abstract

Any disease can be traced back to a genetic disorder. The methods for the detection of chromosome aberrations are therefore of great importance for diagnostics and therapy purposes. Nowadays, the diagnosis of genetic diseases is based on the detection of the corresponding defective gene or on the measurement of either the corresponding transcript by quantitative real-time PCR (RT-qPCR) or the corresponding protein via mass spectrometry. Flow cytometry is also used as standard method to detect, measure and quantify surface proteins specific for cancer cells. Flow cytometry is mainly used in diagnosis for analysis of the cell cycle. One advantage of this is the simultaneous analysis of a large number of cells (e.g. blood cells). A deviation in the cell proliferation rate or an anomaly in cell proliferation indicates a genetic disorder of the cells. Although these methods are well established and used in almost every diagnostic laboratory, they remain indirect gene detection methods. Direct information is obtained using fluorescence in situ hybridisation (FISH), which makes it possible to visualise the relevant genes in situ. Thus, a target gene (sample) is marked with a fluorescent probe and detected in its original position whithin the cell. Important information that can be lost by breaking down the cells and isolating the DNA or RNA is retained with FISH. It makes it possible to obtain information at the level of individual cells. In addition, expression activity can be differentiated from one cell to another. Expression pattern of active cells are differentiated from those that are silent. Fluorescence microscopy is used to visualize these probes. This detection limit of mutated cells is a serious problem, because cancer patients must be medically checked regularly despite the first signs of success after therapy. Only after five years without relapse of the disease (remission) can the physicians and the concerned patients speak about therapeutic success. Despite the development of new dyes and numerous methods for fluorimetric microscopy, which offer an improved signal-to-background ratio, detection is still limited. These methods are based on the production of samples, which are randomly and unquantitatively labelled. The inaccurate limited labelling gives inconsistent probe preparations which provides differences in results. Another problem is the cell itself, which could contain a genetic mutation but do not express it. In this work the Cu(I)-catalysed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) on nucleic acids and on DNA, which was developed in the group of Thomas Carell, was used to develop new fluorescence labelled probes, that offer better sensitivity and a lower signal-to-background ratio

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Click Chemie, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung FISH, Zellproliferation, mRNA-FISH, Diagnostik
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Fakultät für Chemie und Pharmazie
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 1. Februar 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Carell, Thomas