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Assembly of molecular machines in the chloroplast
Assembly of molecular machines in the chloroplast
Chloroplasts arose as a result of the acquisition of a cyanobacterial endosymbiont by a eukaryotic host. The transformation of autonomous prokaryotes into specialized photosynthetic organelles, tightly integrated within the context of the eukaryotic cell, has been accompanied by numerous structural and regulatory adaptations. Consequently, new auxiliary proteins evolved to ensure rapid biogenesis of the organellar complexome. In this thesis, two factors required for the chloroplast ATP synthase (cpATP synthase) and one factor for the chloroplast 70S ribosome assembly process were characterized. CGLD11 is a soluble protein of about 33 kD and could be localized in chloroplasts and mitochondria of Arabidopsis. Cgld11 mutants were growth impaired and accumulated about 20-30% of cpATP synthase, whereas other chloroplast complexes were virtually unaffected. In addition, the loss of CGLD11 impaired cpATP synthase activity but did not affect mitochondrial ATP production. CGLD11 physically interacted with chloroplast and mitochondrial β-subunits in yeast. Thus, a role for CGLD11 in chloroplast F1 assembly was suggested, whereas its function in mitochondria might not be essential. The membranous domain of CGL160 in Arabidopsis (AtCGL160), which shows sequence similarity to the bacterial FO biogenesis factor Atp1/Unc1, was previously shown to be required for c-ring assembly in chloroplasts. Here it could be shown that the N-terminal soluble domain has a distinct function in cpATP synthase biogenesis, since its deletion led to reduced subunit accumulation and diminished proton conductivity of the thylakoid membrane. AtCGL160 was associated with the cpATP synthase holo-complex and the stromal N-terminus specifically interacted with the membrane-proximal domain of CF1-β. Therefore, a central role for AtCGL160 in the assembly of the chloroplast ATP synthase by facilitating c-ring formation and joining of CF1 to CFO was suggested. Compared to AtCGLD11 or AtCGL160, deletion of AtCGL20 caused a more general disruption in chloroplast biogenesis. Arabidopsis plants lacking AtCGL20 proteins displayed a virescent leaf phenotype, were severely growth-retarded under ambient, and growth-arrested under low temperature. Absence of AtCGL20 resulted in reduced chloroplast translational efficiency, impaired post-maturation processing of the 23S rRNA, and abnormal accumulation of 50S ribosomal proteins in the high molecular weight fraction of stromal extracts. Since AtCGL20 was associated to 50S particles in an RNase insensitive manner, an involvement in late assembly steps of the chloroplast large ribosomal subunit was proposed. Taken together, the factors presented in this work are examples of how the assembly of conserved chloroplast complexes has been adapted to the structural and regulatory specialization of the endosymbiont on photosynthesis and may thus help to elucidate the underlying mechanisms of organellar multi-subunit complex formation., Chloroplasten entstanden als Folge des Erwerbs eines cyanobakteriellen Endosymbionten durch einen eukaryotischen Wirt. Die Umwandlung von autonomen Prokaryoten in spezialisierte photosynthetische Organellen, die eng in den Kontext der eukaryotischen Zelle integriert sind, wurde von zahlreichen strukturellen und regulatorischen Anpassungen begleitet. Infolgedessen entstanden neue Hilfsproteine, um eine effiziente Biogenese der Organellen-Komplexe zu gewährleisten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Faktoren für die Assemblierung der Chloroplasten-ATP-Synthase (cpATP-Synthase) und ein Assemblierungsfaktor für chloroplastidäre 70S-Ribosomen charakterisiert. CGLD11 ist ein lösliches 33 kD schweres Protein, welches in Chloroplasten und Mitochondrien von Arabidopsis lokalisiert werden konnte. Cgld11-Mutanten waren wachstumsbeeinträchtigt und akkumulierten etwa 20-30% der cpATP-Synthase-Wildtypmenge, wohingegen andere Chloroplastenkomplexe praktisch unverändert blieben. Darüber hinaus beeinträchtigte der Verlust von CGLD11 die cpATP-Synthase-Aktivität, während die mitochondriale ATP-Generierung nicht verringert war. CGLD11 zeigte eine direkte Interaktion mit der chloroplastidären und mitochondrialen β-Untereinheit in Hefe. Daher wurde eine Rolle für CGLD11 bei der Chloroplasten-F1-Assemblierung vorgeschlagen, während seine Funktion in Mitochondrien möglicherweise nicht essenziell ist. Die Membrandomäne von CGL160 in Arabidopsis (AtCGL160), die Sequenzähnlichkeit mit dem bakteriellen FO-Biogenesefaktor Atp1/Unc1 aufweist, wird für die Bildung von c Ringen in Chloroplasten benötigt. Hier konnte gezeigt werden, dass die N-terminale lösliche Domäne eine spezifische Funktion in der cpATP-Synthase-Biogenese hat, da ihre Abwesenheit zu einer verringerten Anreicherung von Untereinheiten und zu einer verminderten Protonenleitfähigkeit der Thylakoidmembran führte. AtCGL160 war mit dem cpATP-Synthase-Holokomplex assoziiert und der stromale N-Terminus interagierte spezifisch mit der membran-nahen Domäne von CF1-β. Daher wurde eine zentrale Rolle für AtCGL160 in der Assemblierung der Chloroplasten-ATP-Synthase vorgeschlagen, in der AtCGl160 sowohl die c-Ring-Bildung als auch die Zusammenführung von CF1 mit CFO unterstützt. Im Vergleich zu AtCGLD11 oder AtCGL160 verursachte die Deletion von AtCGL20 eine allgemeine Beeinträchtigung der Chloroplasten-Biogenese. Arabidopsis-Pflanzen, denen AtCGL20-Proteine fehlten, zeigten einen vireszenten Blattphänotyp, waren bei Umgebungstemperatur stark wachstumsverzögert und das Wachstum wurde bei niedrigen Temperaturen gestoppt. Verlust von AtCGL20 führte zu einer verminderten chloroplastidären Translationseffizienz, zu einer beeinträchtigten Prozessierung der 23S rRNA und zu einer abnormalen Anreicherung von ribosomalen 50S-Proteinen in der hochmolekularen Fraktion stromaler Extrakte. Da AtCGL20 in einer RNase-unempfindlichen Weise mit 50S-Partikeln assoziiert war, wurde eine Beteiligung an späten Assemblierungsschritten der großen ribosomalen Untereinheit in Chloroplasten vorgeschlagen. Zusammenfassend sind die in dieser Arbeit vorgestellten Faktoren Beispiele dafür, wie die Biogenese konservierter Chloroplastenkomplexe an die strukturelle und regulatorische Spezialisierung des Endosymbionten auf die Photosynthese angepasst wurde, und können somit zur Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen der Bildung von Multi-Untereinheit-Komplexen in Organellen beitragen.
Biochemistry, Molecular Biology, Chloroplast, ATP synthase, Ribosome, Assembly
Reiter, Bennet
2020
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Reiter, Bennet (2020): Assembly of molecular machines in the chloroplast. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Chloroplasts arose as a result of the acquisition of a cyanobacterial endosymbiont by a eukaryotic host. The transformation of autonomous prokaryotes into specialized photosynthetic organelles, tightly integrated within the context of the eukaryotic cell, has been accompanied by numerous structural and regulatory adaptations. Consequently, new auxiliary proteins evolved to ensure rapid biogenesis of the organellar complexome. In this thesis, two factors required for the chloroplast ATP synthase (cpATP synthase) and one factor for the chloroplast 70S ribosome assembly process were characterized. CGLD11 is a soluble protein of about 33 kD and could be localized in chloroplasts and mitochondria of Arabidopsis. Cgld11 mutants were growth impaired and accumulated about 20-30% of cpATP synthase, whereas other chloroplast complexes were virtually unaffected. In addition, the loss of CGLD11 impaired cpATP synthase activity but did not affect mitochondrial ATP production. CGLD11 physically interacted with chloroplast and mitochondrial β-subunits in yeast. Thus, a role for CGLD11 in chloroplast F1 assembly was suggested, whereas its function in mitochondria might not be essential. The membranous domain of CGL160 in Arabidopsis (AtCGL160), which shows sequence similarity to the bacterial FO biogenesis factor Atp1/Unc1, was previously shown to be required for c-ring assembly in chloroplasts. Here it could be shown that the N-terminal soluble domain has a distinct function in cpATP synthase biogenesis, since its deletion led to reduced subunit accumulation and diminished proton conductivity of the thylakoid membrane. AtCGL160 was associated with the cpATP synthase holo-complex and the stromal N-terminus specifically interacted with the membrane-proximal domain of CF1-β. Therefore, a central role for AtCGL160 in the assembly of the chloroplast ATP synthase by facilitating c-ring formation and joining of CF1 to CFO was suggested. Compared to AtCGLD11 or AtCGL160, deletion of AtCGL20 caused a more general disruption in chloroplast biogenesis. Arabidopsis plants lacking AtCGL20 proteins displayed a virescent leaf phenotype, were severely growth-retarded under ambient, and growth-arrested under low temperature. Absence of AtCGL20 resulted in reduced chloroplast translational efficiency, impaired post-maturation processing of the 23S rRNA, and abnormal accumulation of 50S ribosomal proteins in the high molecular weight fraction of stromal extracts. Since AtCGL20 was associated to 50S particles in an RNase insensitive manner, an involvement in late assembly steps of the chloroplast large ribosomal subunit was proposed. Taken together, the factors presented in this work are examples of how the assembly of conserved chloroplast complexes has been adapted to the structural and regulatory specialization of the endosymbiont on photosynthesis and may thus help to elucidate the underlying mechanisms of organellar multi-subunit complex formation.

Abstract

Chloroplasten entstanden als Folge des Erwerbs eines cyanobakteriellen Endosymbionten durch einen eukaryotischen Wirt. Die Umwandlung von autonomen Prokaryoten in spezialisierte photosynthetische Organellen, die eng in den Kontext der eukaryotischen Zelle integriert sind, wurde von zahlreichen strukturellen und regulatorischen Anpassungen begleitet. Infolgedessen entstanden neue Hilfsproteine, um eine effiziente Biogenese der Organellen-Komplexe zu gewährleisten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Faktoren für die Assemblierung der Chloroplasten-ATP-Synthase (cpATP-Synthase) und ein Assemblierungsfaktor für chloroplastidäre 70S-Ribosomen charakterisiert. CGLD11 ist ein lösliches 33 kD schweres Protein, welches in Chloroplasten und Mitochondrien von Arabidopsis lokalisiert werden konnte. Cgld11-Mutanten waren wachstumsbeeinträchtigt und akkumulierten etwa 20-30% der cpATP-Synthase-Wildtypmenge, wohingegen andere Chloroplastenkomplexe praktisch unverändert blieben. Darüber hinaus beeinträchtigte der Verlust von CGLD11 die cpATP-Synthase-Aktivität, während die mitochondriale ATP-Generierung nicht verringert war. CGLD11 zeigte eine direkte Interaktion mit der chloroplastidären und mitochondrialen β-Untereinheit in Hefe. Daher wurde eine Rolle für CGLD11 bei der Chloroplasten-F1-Assemblierung vorgeschlagen, während seine Funktion in Mitochondrien möglicherweise nicht essenziell ist. Die Membrandomäne von CGL160 in Arabidopsis (AtCGL160), die Sequenzähnlichkeit mit dem bakteriellen FO-Biogenesefaktor Atp1/Unc1 aufweist, wird für die Bildung von c Ringen in Chloroplasten benötigt. Hier konnte gezeigt werden, dass die N-terminale lösliche Domäne eine spezifische Funktion in der cpATP-Synthase-Biogenese hat, da ihre Abwesenheit zu einer verringerten Anreicherung von Untereinheiten und zu einer verminderten Protonenleitfähigkeit der Thylakoidmembran führte. AtCGL160 war mit dem cpATP-Synthase-Holokomplex assoziiert und der stromale N-Terminus interagierte spezifisch mit der membran-nahen Domäne von CF1-β. Daher wurde eine zentrale Rolle für AtCGL160 in der Assemblierung der Chloroplasten-ATP-Synthase vorgeschlagen, in der AtCGl160 sowohl die c-Ring-Bildung als auch die Zusammenführung von CF1 mit CFO unterstützt. Im Vergleich zu AtCGLD11 oder AtCGL160 verursachte die Deletion von AtCGL20 eine allgemeine Beeinträchtigung der Chloroplasten-Biogenese. Arabidopsis-Pflanzen, denen AtCGL20-Proteine fehlten, zeigten einen vireszenten Blattphänotyp, waren bei Umgebungstemperatur stark wachstumsverzögert und das Wachstum wurde bei niedrigen Temperaturen gestoppt. Verlust von AtCGL20 führte zu einer verminderten chloroplastidären Translationseffizienz, zu einer beeinträchtigten Prozessierung der 23S rRNA und zu einer abnormalen Anreicherung von ribosomalen 50S-Proteinen in der hochmolekularen Fraktion stromaler Extrakte. Da AtCGL20 in einer RNase-unempfindlichen Weise mit 50S-Partikeln assoziiert war, wurde eine Beteiligung an späten Assemblierungsschritten der großen ribosomalen Untereinheit in Chloroplasten vorgeschlagen. Zusammenfassend sind die in dieser Arbeit vorgestellten Faktoren Beispiele dafür, wie die Biogenese konservierter Chloroplastenkomplexe an die strukturelle und regulatorische Spezialisierung des Endosymbionten auf die Photosynthese angepasst wurde, und können somit zur Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen der Bildung von Multi-Untereinheit-Komplexen in Organellen beitragen.