The role of roX RNA in dosage compensation during Drosophila melanogaster embryogenesis

Prayitno, Khairunnadiya (2020): The role of roX RNA in dosage compensation during Drosophila melanogaster embryogenesis. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Dosage compensation (DC) in male Drosophila melanogaster flies is done through hypertranscription of the X chromosome. This involves the dosage compensation complex (DCC), a ribonucleoprotein complex of five protein subunits, Male-specific-lethal 1 (MSL1), MSL2, MSL3, Males-absent-on-the-first (MOF) and Maleless (MLE), and long noncoding RNA, RNA-on-the-X (roX), encoded by either roX1 or roX2 gene. DC is interlinked with the process of sex determination. A hypothesis suggests that upon hybridization of roX1 and roX2 RNAs, a miRNA is produced that is implicated in a feedback mechanism of sex determination. Different approaches were used to reproduce hybridization and validate putative miRNA; however, such observations could not be seen. As differential function of roX RNAs have been proposed, characterization of roX1 and roX2 RNAs in fractionated extracts were done by rt-qPCR. Long isoforms of roX, roX1-RE and roX2-RB, tended to be polyadenylated and enriched in the cytoplasm suggesting differential post-transcriptional processing and possible shuttling mechanism. A preliminary experiment of direct-RNA nanopore sequencing detected major parts of roX RNAs important for DC. With improved protocol of RNA preservation and library preparation, it may prove to be a potent tool to further characterize the lncRNAs and profile its isoforms. Additionally, a detailed study on the establishment of dosage compensation during early embryogenesis was done. MSL2 binding to DNA was evident 4 hours after egg laying when least compensation of X-linked genes is observed. Concurrent detection of MOF on the X chromosome signified assembly of DCC in early development. This complex was active in its function to acetylate H4K16. Nevertheless, accumulation of H4K16ac on the X chromosome proceeded in a time- and space-dependent manner, coinciding with the progression of dosage compensation. Specifically, genes defined as constitutive were closer to DCC binding sites, more acetylated, and first compensated. Meanwhile, genes characterized as developmental were farther from DCC binding sites, lowly acetylated, and slowly compensated.

Abstract

Die Dosiskompensation bei männlichen Drosophila melanogaster Fliegen erfolgt durch Übertranskription des X-Chromosoms. Dies wird durch den Dosiskompensationskomplex (DCC) ermöglicht. Dieser Ribonukleoproteinkomplex besteht aus fünf Proteinuntereinheiten, Male-specific-lethal 1 (MSL1), MSL2, MSL3, Males-absent-on-the-first (MOF) und Maleless (MLE), und einer langen nichtkodierenden RNA, RNA-on-the-X (roX), die entweder durch das roX1- oder das roX2-Gen kodiert wird. Die Dosiskompensation ist mit dem Prozess der Geschlechtsdetermination verbunden. Die Hypothese, dass bei Hybridisierung von roX1- und roX2-RNAs eine miRNA erzeugt wird, die an einem Rückkopplungsmechanismus der Geschlechtsdetermination beteiligt ist, wurde in dieser Arbeit getestet. Leider konnten vorangegangene, hypothesenstützende Beobachtungen nicht reproduziert werden. Für die roX-RNAs wurde eine redundante Rolle in der Dosiskompensation sowie zusätzliche Funktionen außerhalb dieses Prozesses vorgeschlagen. Diese Dissertation umfasst die Charakterisierung von roX1- und roX2-RNAs in fraktionierten Embryoextrakten durch RT-qPCR. Die Ergebnisse deuten auf eine differenzielle posttranskriptionale Verarbeitung der RNAs hin. Lange Isoformen von roX, roX1-RE und roX2-RB sind polyadenyliert. Darüber hinaus sind sie im Zytoplasma angereichert, was auf einen möglichen Austausch mit dem Nucleus hindeutet. Definierende Abschnitte der für DC wichtigen roX-RNAs wurden in einem explorativen Experiment durch direct-RNA nanopore Sequenzieren nachgewiesen. Mit einem verbesserten Protokoll zur Extraktion der RNA, sowie deren Konservation und Bibliotheksvorbereitung könnte es sich als wirksames Instrument zur weiteren Charakterisierung der langen nichtkodierenden RNA und auch in Bezug auf die Selektion der RNA-Isoformen erweisen. Zudem wurde im Rahmen dieser Arbeit eine detaillierte Studie zur Etablierung der Dosiskompensation während der frühen Embryogenese durchgeführt. Die Bindung von MSL2 an DNA war bereits 4 Stunden nach der Eiablage messbar. Zu diesem Zeitpinkt ist nur eine geringe Dosiskompensation von X-Chromosom gekoppelten Genen vorhanden. Gleichzeitig ließ sich ebenfalls MOF bereits in derselben Region auf dem X-Chromosom nachweisen. Dies zeigte die Bildung des DCC in der frühen Embryogenese. Der Komplex war bereits aktiv und acetylierte H4K16. Trotzdem verlief die Akkumulation von H4K16ac auf dem X-Chromosom nachfolgend zeit- und positionsabhängig, übereinstimmend mit dem Fortschreiten der Dosiskompensation. So wurden Gene, die als konstitutiv definiert wurden und näher an DCC-Bindungsstellen lagen, stärker acetyliert und zuerst kompensiert. Als Entwicklungsgene definierte Gene hingegen, lagen weiter von DCC-Bindungsstellen entfernt, wurden nur schwach acetyliert und langsam kompensiert.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Chromatin, Dosage Compensation, Embryogenesis, lncRNA, hypertranscription
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 5. Juni 2020
• 1. Bericht­erstatter:in: Becker, Peter