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Die Dynamik des axoplasmatischen Retikulums in Modellen der Neuroinflammation und des spinalen Traumas
Die Dynamik des axoplasmatischen Retikulums in Modellen der Neuroinflammation und des spinalen Traumas
Despite the fact that little is known about the endoplasmic reticulum (ER) in axons, it is repeatedly implicated as a potential effector in neurodegeneration. Our laboratory has demonstrated the impairment of mitochondrial structure and axonal transport in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which has raised the question of whether the ER could also be involved. Since we have established that increased cytoplasmic calcium levels determine the axonal fate in EAE, the ER (which can maintain ten-thousand-fold the cytoplasmic calcium concentration) was considered a possible source of elevated detrimental cytoplasmic calcium. In order to measure ER calcium, the genetically encoded ratiometric and low-affinity calcium indicator Twitch2B 54S+ was targeted to the ER and characterised in cell culture. Subsequently, the novel transgenic mouse line Thy1-TwitchER was generated, screened for suitable subset axonal labelling and pharmacologically characterised via a 2-photon spinal-cord in-vivo imaging approach. A dynamic range of 300% (Rmax/Rmin) was determined by ER depletion with the sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase inhibitor thapsigargin. Inducing EAE in Thy1-TwitchER mice revealed that axons undergoing focal-axonal degeneration (FAD) did not display a marked decrease of ER calcium unless the axonal continuity had already been disrupted. Consequently, cytoplasmic calcium elevations in FAD are not caused by ER calcium release, but rather by calcium entering the axons through plasma-membrane nanopores, as corresponding work in our laboratory concluded. However, in the paradigms of spinal-cord contusion and laser-transection injury, a marked depletion of ER calcium could be measured. This depletion coincided with the structural alteration of ER fragmentation, which had hitherto only been described in dendrites following cardiac arrest. Traumatic axonal ER fragmentation and ER calcium depletion were demonstrated to be partially reversible over a period of several hours. In the future, the Thy1-TwitchER mouse line could be employed to screen further neuronal-disease paradigms for structural and functional ER alterations. In addition, this mouse line could serve as a valuable tool for physiological research, for example regarding the role of ER calcium in synaptic plasticity., Kalzium ist von zentraler Bedeutung im Prozess der axonalen Degeneration. In Vorarbeiten zu der hier vorliegenden Arbeit gelang es mittels intravitaler 2-Photonen- Mikroskopie nachzuweisen, dass der Anstieg des intraaxonalen zytoplasmatischen Kalziums maßgeblich das Schicksal von Axonen in neuroinflammatorischen Läsionen beeinflusst. Axone mit erhöhtem zytoplasmatischem Kalziumgehalt zeigten eine höhere Tendenz den Degenerationsprozess der so genannten fokalen axona- len Degeneration (FAD) bis hin zur irreversiblen Fragmentierung zu durchlaufen. Als mögliche Quelle des beobachteten Kalziumanstiegs in läsionalen Axonen der experimentellen Autoimmunenzaphalomyelitis (EAE), einem Mausmodell der Multiplen Sklerose, war das endoplasmatische Retikulum (ER) mit einer Kalziumkon- zentration, die das Zehntausendfache der zytoplasmatischen Kalziumkonzentration betragen kann, von besonderem Interesse. Um Messungen der Kalziumkonzentration des endoplasmatischen Retikulums durchführen zu können, exprimierten wir zunächst den Kalziumindikator Twitch2B 54 S+ im endoplasmatischen Retikulum und charakterisierten den Sensor in HEK293-Zellen. Die Vorteile dieses Kalziumindikators liegen darin, dass er genetisch kodiert ist und ratiometrische Messungen erlaubt, welche eine Voraussetzung für die in-vivo Mikroskopie darstellen. Mit Twitch2B 54 S+ ER unter der Kontrolle des neuronalen Thy1 Promoters generierten wir transgene Mauslinien, welche wir nach für die intravitale spinale 2-Photonen-Mikroskopie geeigneten spinalen axonaler Expressionsmustern auswählten und pharmakologisch charakterisierten. Unter in-vivo Bedingungen konnte nach ER-Kalzium Depletierung durch Zugabe des SERCA-Inhibitors Thapsigargin ein Sensor-Dynamikbereich von 300 Prozent (Rmax/Rmin) ermittelt werden. Im weiteren Verlauf untersuchten wir mit den Thy1- TwitchER Mäusen auch die FAD. Eine Reduktion des ER-Kalziumgehalts konnte hier nur in irreversibel geschädigten, fragmentierten Axonen gemessen werden. Somit war es möglich, eine ER-Kalziumfreisetzung als Ursache für den in der FAD beobachteten frühen zytoplasmatischen Kalziumanstieg auszuschließen. Nachfol- gende Experimente unserer Arbeitsgruppe konnten stattdessen plasmalemmale Nanoporen als Eintrittspforte des vermehrten zytoplasmatischen Kalziums in EAE- Läsionen identifizieren. Im Unterschied zur FAD konnte in einem spinalen Kontusionsmodell sowie in spinalen Laserläsionen eine deutliche ER-Kalziumfreisetzung gemessen werden. Diese Depletierung ging mit strukturellen Alterationen in Form einer ER Fragmen- tierung einher. Der Prozess der ER Fragmentierung war bisher nur in Dendriten in einem Herzstillstand-Modell beschrieben. Die beobachtete traumatische ER Frag- mentierung und ER Kalziumdepletierung waren über einen Zeitraum von mehreren Stunden partiell reversibel. In der Zukunft könnte die Thy1-TwitchER Mauslinie es ermöglichen weitere neurologische Erkrankungen auf strukturelle und funktionelle ER Alterationen zu untersu- chen, wie wir sie in Kontusionen und Laserläsionen nachweisen konnten, sowie deren biologische Relevanz zu evaluieren. Auch für physiologische Fragestellungen, wie zum Beispiel der Einfluss von ER-Kalzium bei der synaptischen Plastizität, stellt die Thy1-TwitchER Mauslinie ein wertvolles Modell dar.
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Scheiter, Alexander
2020
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Scheiter, Alexander (2020): Die Dynamik des axoplasmatischen Retikulums in Modellen der Neuroinflammation und des spinalen Traumas. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Despite the fact that little is known about the endoplasmic reticulum (ER) in axons, it is repeatedly implicated as a potential effector in neurodegeneration. Our laboratory has demonstrated the impairment of mitochondrial structure and axonal transport in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which has raised the question of whether the ER could also be involved. Since we have established that increased cytoplasmic calcium levels determine the axonal fate in EAE, the ER (which can maintain ten-thousand-fold the cytoplasmic calcium concentration) was considered a possible source of elevated detrimental cytoplasmic calcium. In order to measure ER calcium, the genetically encoded ratiometric and low-affinity calcium indicator Twitch2B 54S+ was targeted to the ER and characterised in cell culture. Subsequently, the novel transgenic mouse line Thy1-TwitchER was generated, screened for suitable subset axonal labelling and pharmacologically characterised via a 2-photon spinal-cord in-vivo imaging approach. A dynamic range of 300% (Rmax/Rmin) was determined by ER depletion with the sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase inhibitor thapsigargin. Inducing EAE in Thy1-TwitchER mice revealed that axons undergoing focal-axonal degeneration (FAD) did not display a marked decrease of ER calcium unless the axonal continuity had already been disrupted. Consequently, cytoplasmic calcium elevations in FAD are not caused by ER calcium release, but rather by calcium entering the axons through plasma-membrane nanopores, as corresponding work in our laboratory concluded. However, in the paradigms of spinal-cord contusion and laser-transection injury, a marked depletion of ER calcium could be measured. This depletion coincided with the structural alteration of ER fragmentation, which had hitherto only been described in dendrites following cardiac arrest. Traumatic axonal ER fragmentation and ER calcium depletion were demonstrated to be partially reversible over a period of several hours. In the future, the Thy1-TwitchER mouse line could be employed to screen further neuronal-disease paradigms for structural and functional ER alterations. In addition, this mouse line could serve as a valuable tool for physiological research, for example regarding the role of ER calcium in synaptic plasticity.

Abstract

Kalzium ist von zentraler Bedeutung im Prozess der axonalen Degeneration. In Vorarbeiten zu der hier vorliegenden Arbeit gelang es mittels intravitaler 2-Photonen- Mikroskopie nachzuweisen, dass der Anstieg des intraaxonalen zytoplasmatischen Kalziums maßgeblich das Schicksal von Axonen in neuroinflammatorischen Läsionen beeinflusst. Axone mit erhöhtem zytoplasmatischem Kalziumgehalt zeigten eine höhere Tendenz den Degenerationsprozess der so genannten fokalen axona- len Degeneration (FAD) bis hin zur irreversiblen Fragmentierung zu durchlaufen. Als mögliche Quelle des beobachteten Kalziumanstiegs in läsionalen Axonen der experimentellen Autoimmunenzaphalomyelitis (EAE), einem Mausmodell der Multiplen Sklerose, war das endoplasmatische Retikulum (ER) mit einer Kalziumkon- zentration, die das Zehntausendfache der zytoplasmatischen Kalziumkonzentration betragen kann, von besonderem Interesse. Um Messungen der Kalziumkonzentration des endoplasmatischen Retikulums durchführen zu können, exprimierten wir zunächst den Kalziumindikator Twitch2B 54 S+ im endoplasmatischen Retikulum und charakterisierten den Sensor in HEK293-Zellen. Die Vorteile dieses Kalziumindikators liegen darin, dass er genetisch kodiert ist und ratiometrische Messungen erlaubt, welche eine Voraussetzung für die in-vivo Mikroskopie darstellen. Mit Twitch2B 54 S+ ER unter der Kontrolle des neuronalen Thy1 Promoters generierten wir transgene Mauslinien, welche wir nach für die intravitale spinale 2-Photonen-Mikroskopie geeigneten spinalen axonaler Expressionsmustern auswählten und pharmakologisch charakterisierten. Unter in-vivo Bedingungen konnte nach ER-Kalzium Depletierung durch Zugabe des SERCA-Inhibitors Thapsigargin ein Sensor-Dynamikbereich von 300 Prozent (Rmax/Rmin) ermittelt werden. Im weiteren Verlauf untersuchten wir mit den Thy1- TwitchER Mäusen auch die FAD. Eine Reduktion des ER-Kalziumgehalts konnte hier nur in irreversibel geschädigten, fragmentierten Axonen gemessen werden. Somit war es möglich, eine ER-Kalziumfreisetzung als Ursache für den in der FAD beobachteten frühen zytoplasmatischen Kalziumanstieg auszuschließen. Nachfol- gende Experimente unserer Arbeitsgruppe konnten stattdessen plasmalemmale Nanoporen als Eintrittspforte des vermehrten zytoplasmatischen Kalziums in EAE- Läsionen identifizieren. Im Unterschied zur FAD konnte in einem spinalen Kontusionsmodell sowie in spinalen Laserläsionen eine deutliche ER-Kalziumfreisetzung gemessen werden. Diese Depletierung ging mit strukturellen Alterationen in Form einer ER Fragmen- tierung einher. Der Prozess der ER Fragmentierung war bisher nur in Dendriten in einem Herzstillstand-Modell beschrieben. Die beobachtete traumatische ER Frag- mentierung und ER Kalziumdepletierung waren über einen Zeitraum von mehreren Stunden partiell reversibel. In der Zukunft könnte die Thy1-TwitchER Mauslinie es ermöglichen weitere neurologische Erkrankungen auf strukturelle und funktionelle ER Alterationen zu untersu- chen, wie wir sie in Kontusionen und Laserläsionen nachweisen konnten, sowie deren biologische Relevanz zu evaluieren. Auch für physiologische Fragestellungen, wie zum Beispiel der Einfluss von ER-Kalzium bei der synaptischen Plastizität, stellt die Thy1-TwitchER Mauslinie ein wertvolles Modell dar.