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Analysis of P2X7 protein complexes in a P2X7-EGFP BAC transgenic mouse model
Analysis of P2X7 protein complexes in a P2X7-EGFP BAC transgenic mouse model
P2X receptors are trimeric non-selective cation channels, gated by extracellular ATP. The P2X7 subtype differs from the other six P2X receptor family members (P2X1 - P2X6) among other things, by its low sensitivity to ATP and its extended cytoplasmic C-terminal domain. The receptor is expressed in a variety of cell types, with high expression in immune cells. Activation of P2X7 leads to the assembly of the NLRP3 inflammasome, resulting in caspase-1 activation and subsequent release of the mature proinflammatory cytokines IL-1beta and IL-18. Accordingly, P2X7 signaling has been associated with a variety of inflammatory diseases, like pulmonary diseases, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, and neurodegenerative diseases. Thus, the receptor has gained attention as a promising drug target. However, its cell type-specific localization, as well as the proteins involved in its trafficking, signaling, and functional modulation are still ambiguous. In addition, a heteromeric assembly with the P2X4 subtyp is still a matter of debate. These uncertainties stand in sharp contrast to its role as a drug target. Herein, a novel P2X7-EGFP BAC transgenic mouse model was used to determine P2X7 localization and its interaction with novel proteins, as well as the P2X4 subtype. In this study, the mouse model was characterized in detail. To exclude an aberrant expression of the transgenic protein, membrane localization and distribution in different brain regions was biochemically investigated. By using conditional P2rx7-/- mice, a previously observed dominant expression in microglia and oligodentrocytes was validated. This was further confirmed by immunofluorescence labeling and confocal microscopy. Additionally, the postulated interaction with the P2X4 subunit was investigated to examine the distribution, mutual interrelation, and the physical interaction of both subunits in vivo. In contrast to previous reports, no significant interaction was observed in native mouse tissue. As the major part of this study, the BAC transgenic mouse line was used to identify novel interaction partners of the P2X7 receptor. Therefore, a protocol for quantitative in situ cross-linking of P2X7 complexes in native lung tissue was established and used to co-purify interacting proteins cross-linked to P2X7. Subsequent analysis by mass spectrometry identified 41 significantly enriched proteins, of which several are involved in leukocyte migration. This allows us to link a previously described P2X7-mediated infiltration of leukocytes to a direct physical interaction of P2X7 with distinct cell adhesion molecules, like Integrin beta-2, ICAM-1, PECAM-1 and MCAM. Overall, this study addressed long discussed questions in P2X7 research and can help to understand signaling effects of P2X7 activation. This could lead to new treatment strategies of disease, in which P2X7 plays a major role., P2X Rezeptoren sind trimere, nicht-selektive Kationenkanäle, die durch extrazelluläres ATP aktiviert werden. Der P2X7 Subtyp unterscheidet sich von den anderen sechs Mitgliedern der P2X Rezeptorfamilie (P2X1 - P2X6) unter anderem durch seine geringe Sensitivität gegenüber ATP und seiner langen zytoplasmatischen, C-terminalen Domäne. Der Rezeptor wird in verschiedenen Zelltypen exprimiert, mit einer hohen Expressionsrate in Immunzellen. P2X7 Aktivierung führt zur Assemblierung des NLRP3 Inflammasoms, was zur anschließenden Freisetzung der reifen proinflammatorischen Zytokine IL-1beta und IL-18 führt. Entsprechend wurde der Rezeptor mit einer Vielzahl von inflammatorischen Krankheiten, wie beispielsweise Lungenerkrankungen, rheumatoider Arthritis, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht und als vielversprechendes Zielprotein für Arzneimittel in Betracht gezogen. Trotzdem sind die zelltyp-spezifische Lokalisation des Rezeptors sowie die Proteine, die an dessen Transport, Signalwegen und funktioneller Modulation beteiligt sind, nach wie vor weitestgehend unbekannt. Darüber hinaus ist auch die heteromere Assemblierung mit dem P2X4 Subtyp immer noch umstritten. Diese Ungewissheiten stehen in einem starken Kontrast zu seiner Rolle als Zielprotein für die Arzneimittelherstellung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues P2X7-EGFP BAC transgenes Mausmodell verwendet, um die Lokalisation von P2X7 und dessen Interaktion mit neuen Proteinen sowie mit dem P2X4 Subtyp aufzuklären. Im ersten Teil der Arbeit wurde das Mausmodell im Detail charakterisiert. Um eine abweichende Expression des transgenen Proteins auszuschließen, wurde die Membranlokalisation und dessen Präsenz in verschiedenen Gehirnregionen biochemisch untersucht. Mit Hilfe von konditionellen P2rx7-/- Mäusen wurde eine zuvor beobachtete dominante Expression in Mikroglia und Oligodendrozyten bestätigt. Dies wurde desweiteren mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbung und Konfokalmikroskopie validiert. Im zweiten Teil wurde die postulierte Interaktion mit dem P2X4 Rezeptor untersucht, um die Verteilung der beiden Subtypen, deren gegenseitige Beeinflussung, sowie deren physikalische Interaktion in vivo zu analysieren. Im Gegensatz zu bisherigen Studien, wurde in nativem Mausgewebe keine signifikante Interaktion beobachtet. Als Hauptteil dieser Arbeit wurde die BAC transgene Mauslinie verwendet, um neue Interaktionspartner des P2X7 Rezeptors zu identifizieren. Hierfür wurde ein Protokoll etabliert, welches quantitatives in situ Quervernetzen von P2X7 Proteinkomplexen in nativem Mausgewebe ermöglicht, um interagierende, an P2X7 kovalent gebundene Proteine mit aufzureinigen. Durch die anschließende massenspektrometrische Analyse wurden 41 signifikant angereicherte Proteine identifiziert, von denen einige in die Migration von Leukozyten involviert sind. Dies ermöglicht es, eine zuvor beschriebene P2X7-vermittelte Einwanderung von Leukozyten mit der direkten, physikalischen Interaktion von P2X7 mit Zelladhäsionsmolekülen, wie Integrin beta-2, ICAM-1, PECAM-1 und MCAM in Verbindung zu bringen. Zusammenfassend behandelte diese Arbeit langjährig diskutierte Fragestellungen im Forschungsfeld des P2X7 Rezeptors und kann dabei helfen, die Effekte der P2X7 Aktivierung auf verschiedene Signalwege zu verstehen. Dies könnte dazu beitragen, neue Behandlungsstrategien für Krankheiten zu eröffnen, bei denen P2X7 eine entscheidende Rolle spielt.
P2X4, P2rx4, P2X7, P2rx7, purinergic signaling, protein-protein interactions
Kopp, Robin
2020
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Kopp, Robin (2020): Analysis of P2X7 protein complexes in a P2X7-EGFP BAC transgenic mouse model. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

P2X receptors are trimeric non-selective cation channels, gated by extracellular ATP. The P2X7 subtype differs from the other six P2X receptor family members (P2X1 - P2X6) among other things, by its low sensitivity to ATP and its extended cytoplasmic C-terminal domain. The receptor is expressed in a variety of cell types, with high expression in immune cells. Activation of P2X7 leads to the assembly of the NLRP3 inflammasome, resulting in caspase-1 activation and subsequent release of the mature proinflammatory cytokines IL-1beta and IL-18. Accordingly, P2X7 signaling has been associated with a variety of inflammatory diseases, like pulmonary diseases, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, and neurodegenerative diseases. Thus, the receptor has gained attention as a promising drug target. However, its cell type-specific localization, as well as the proteins involved in its trafficking, signaling, and functional modulation are still ambiguous. In addition, a heteromeric assembly with the P2X4 subtyp is still a matter of debate. These uncertainties stand in sharp contrast to its role as a drug target. Herein, a novel P2X7-EGFP BAC transgenic mouse model was used to determine P2X7 localization and its interaction with novel proteins, as well as the P2X4 subtype. In this study, the mouse model was characterized in detail. To exclude an aberrant expression of the transgenic protein, membrane localization and distribution in different brain regions was biochemically investigated. By using conditional P2rx7-/- mice, a previously observed dominant expression in microglia and oligodentrocytes was validated. This was further confirmed by immunofluorescence labeling and confocal microscopy. Additionally, the postulated interaction with the P2X4 subunit was investigated to examine the distribution, mutual interrelation, and the physical interaction of both subunits in vivo. In contrast to previous reports, no significant interaction was observed in native mouse tissue. As the major part of this study, the BAC transgenic mouse line was used to identify novel interaction partners of the P2X7 receptor. Therefore, a protocol for quantitative in situ cross-linking of P2X7 complexes in native lung tissue was established and used to co-purify interacting proteins cross-linked to P2X7. Subsequent analysis by mass spectrometry identified 41 significantly enriched proteins, of which several are involved in leukocyte migration. This allows us to link a previously described P2X7-mediated infiltration of leukocytes to a direct physical interaction of P2X7 with distinct cell adhesion molecules, like Integrin beta-2, ICAM-1, PECAM-1 and MCAM. Overall, this study addressed long discussed questions in P2X7 research and can help to understand signaling effects of P2X7 activation. This could lead to new treatment strategies of disease, in which P2X7 plays a major role.

Abstract

P2X Rezeptoren sind trimere, nicht-selektive Kationenkanäle, die durch extrazelluläres ATP aktiviert werden. Der P2X7 Subtyp unterscheidet sich von den anderen sechs Mitgliedern der P2X Rezeptorfamilie (P2X1 - P2X6) unter anderem durch seine geringe Sensitivität gegenüber ATP und seiner langen zytoplasmatischen, C-terminalen Domäne. Der Rezeptor wird in verschiedenen Zelltypen exprimiert, mit einer hohen Expressionsrate in Immunzellen. P2X7 Aktivierung führt zur Assemblierung des NLRP3 Inflammasoms, was zur anschließenden Freisetzung der reifen proinflammatorischen Zytokine IL-1beta und IL-18 führt. Entsprechend wurde der Rezeptor mit einer Vielzahl von inflammatorischen Krankheiten, wie beispielsweise Lungenerkrankungen, rheumatoider Arthritis, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht und als vielversprechendes Zielprotein für Arzneimittel in Betracht gezogen. Trotzdem sind die zelltyp-spezifische Lokalisation des Rezeptors sowie die Proteine, die an dessen Transport, Signalwegen und funktioneller Modulation beteiligt sind, nach wie vor weitestgehend unbekannt. Darüber hinaus ist auch die heteromere Assemblierung mit dem P2X4 Subtyp immer noch umstritten. Diese Ungewissheiten stehen in einem starken Kontrast zu seiner Rolle als Zielprotein für die Arzneimittelherstellung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues P2X7-EGFP BAC transgenes Mausmodell verwendet, um die Lokalisation von P2X7 und dessen Interaktion mit neuen Proteinen sowie mit dem P2X4 Subtyp aufzuklären. Im ersten Teil der Arbeit wurde das Mausmodell im Detail charakterisiert. Um eine abweichende Expression des transgenen Proteins auszuschließen, wurde die Membranlokalisation und dessen Präsenz in verschiedenen Gehirnregionen biochemisch untersucht. Mit Hilfe von konditionellen P2rx7-/- Mäusen wurde eine zuvor beobachtete dominante Expression in Mikroglia und Oligodendrozyten bestätigt. Dies wurde desweiteren mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbung und Konfokalmikroskopie validiert. Im zweiten Teil wurde die postulierte Interaktion mit dem P2X4 Rezeptor untersucht, um die Verteilung der beiden Subtypen, deren gegenseitige Beeinflussung, sowie deren physikalische Interaktion in vivo zu analysieren. Im Gegensatz zu bisherigen Studien, wurde in nativem Mausgewebe keine signifikante Interaktion beobachtet. Als Hauptteil dieser Arbeit wurde die BAC transgene Mauslinie verwendet, um neue Interaktionspartner des P2X7 Rezeptors zu identifizieren. Hierfür wurde ein Protokoll etabliert, welches quantitatives in situ Quervernetzen von P2X7 Proteinkomplexen in nativem Mausgewebe ermöglicht, um interagierende, an P2X7 kovalent gebundene Proteine mit aufzureinigen. Durch die anschließende massenspektrometrische Analyse wurden 41 signifikant angereicherte Proteine identifiziert, von denen einige in die Migration von Leukozyten involviert sind. Dies ermöglicht es, eine zuvor beschriebene P2X7-vermittelte Einwanderung von Leukozyten mit der direkten, physikalischen Interaktion von P2X7 mit Zelladhäsionsmolekülen, wie Integrin beta-2, ICAM-1, PECAM-1 und MCAM in Verbindung zu bringen. Zusammenfassend behandelte diese Arbeit langjährig diskutierte Fragestellungen im Forschungsfeld des P2X7 Rezeptors und kann dabei helfen, die Effekte der P2X7 Aktivierung auf verschiedene Signalwege zu verstehen. Dies könnte dazu beitragen, neue Behandlungsstrategien für Krankheiten zu eröffnen, bei denen P2X7 eine entscheidende Rolle spielt.