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In-vitro Tissue Engineering von zellbesiedelten Polyurethan-Scaffolds: Bildung von extrazellulärer Matrix unter Einfluss von endothelialer Beschichtung und pulsatilem Fluss
In-vitro Tissue Engineering von zellbesiedelten Polyurethan-Scaffolds: Bildung von extrazellulärer Matrix unter Einfluss von endothelialer Beschichtung und pulsatilem Fluss
Der Ersatz erkrankter Organ- und Gewebestrukturen des Herz-Kreislauf-Systems erlangt aufgrund der steigenden Anzahl an kardiovaskulären Erkrankungen zunehmende Bedeutung. Eine Möglichkeit, welche erkrankte Strukturen in ihrer Gesamtheit unter Erhalt der Funktionalität und Bewahrung der morphologischen Eigenschaften ersetzen könnte, ist Bestand des Forschungsgebiets des kardiovaskulären Tissue Engineerings (TE). Entscheidendes Merkmal der tissue-engineerten Konstrukte ist deren Vitalität: Dabei sind es vitale Zellen, welche ein funktionelles und morphologisch ähnliches Ersatzgewebe auf Trägermaterialien bilden. Dieses Ersatzgewebe ermöglicht im Idealfall Wachstum, Regeneration und Entwicklung des Konstruktes zu gesundem, kardiovaskulärem Gewebe. Diese Arbeit analysiert die Bildung extrazellulärer Matrix (EZM) auf einem Polyurethan (PU)-Trägermaterial unter Vergleich unterschiedlicher Besiedelungs- und Konditionierungsregime. Humane Endothelzellen (EC) und Fibroblasten (FB) konnten aus Vena saphena magna-Segmenten enzymatisch isoliert werden. Vorab wurden vier Gruppen (G1 - G4) à fünf tubulären PU-Scaffolds (Durchmesser = 3,3 cm) bestimmt. Zunächst wurden die PU-Scaffolds aller Gruppen für 24 Stunden mit FB (750.000 Zellen/cm2) dynamisch besiedelt und folgend für drei Tage statisch kultiviert. Anschließend konnten die PU-Scaffolds zweier Gruppen zusätzlich mit EC (750.000/cm2) für 24 Stunden dynamisch besiedelt und für drei Tage statisch kultiviert werden. Im Anschluss an die Besiedelungsprozesse wurden die PU-Scaffolds für sieben Tage entweder statisch kultiviert oder dynamisch konditioniert. Die dynamische Konditionierung erfolgte in einem Bioreaktor unter Anwendung eines pulsatilen Flusses mit einer initialen Flussrate von 690 ml/min, welche nach drei Tagen auf 2.100 ml/min erhöht wurde. Entnommene Proben konnten mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM), Live/Dead®- (LD), Immunfluoreszenz- (IF) und histologischen Färbungen sowie quantitativer Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (rt-PCR) analysiert werden. Nach statischer Kultivierung und dynamischer Konditionierung wurden pH-Wert-Messungen des Mediums durchgeführt. Die REM-Analyse bestätigte das Vorhandensein einer Zellschicht auf dem PU-Material. In den LD-Färbungen aller Proben war die Mehrheit der Zellen vital. Die Anwesenheit von FB und EC bestätigte der Nachweis von TE-7 (FB-spezifisch) und von-Willebrand-Faktor (vWF; EC-spezifisch) in IF-Färbungen. Weitere IF- und histologische Färbungen ergaben die Anwesenheit von EZM-Bestandteilen: Elastin, Fibronectin sowie Kollagene. Eine EC-Besiedlung mit dynamischer Konditionierung förderte die Bildung von EZM-Bestandteilen. PU als synthetisches Trägermaterial sowie humane FB und EC eigneten sich für den vorliegenden Versuchsansatz. Die Exposition der Zellen gegenüber dem pulsatilen Fluss im Bioreaktor provozierte die Entstehung von EZM-Bestandteilen. Insgesamt führten sowohl dynamische Besiedelungs- als auch dynamische Konditionierungsprozesse zu einer verbesserten Zellmorphologie und damit zu einer gesteigerten EZM-Bildung. Im Vergleich waren weniger EZM-Bestandteile in den statisch kultivierten Proben nachzuweisen. Die zusätzliche Beschichtung mit EC wirkte sich positiv auf die Bildung der EZM aus. Die FB-Schicht stellte eine optimale Grundlage für die EC-Adhäsion dar. Die alleinige Besiedelung der PU-Scaffolds mit FB führte zu einem Ablösen der Zellen und damit zu einer reduzierten EZM-Bildung. In Hinblick auf die weltweit hohe Mortalität kardiovaskulärer Erkrankungen ist die Regeneration von Gefäßen und Myokard sowie die Herstellung von tissue-engineerten Herzklappen (TEHV = engl. tissue-engineered heart valve) von besonderem klinischen Interesse. Fortschritte auf dem Gebiet des kardiovaskulären TE können zum zukünftigen Ersatz von dysfunktionalem Gewebe einen entscheidenden Beitrag leisten.
Tissue Engineering, Bioreaktor, dynamische Zellkonditionierung, extrazelluläre Matrix, kardiovaskulär
Witzel, Katja
2020
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Witzel, Katja (2020): In-vitro Tissue Engineering von zellbesiedelten Polyurethan-Scaffolds: Bildung von extrazellulärer Matrix unter Einfluss von endothelialer Beschichtung und pulsatilem Fluss. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Der Ersatz erkrankter Organ- und Gewebestrukturen des Herz-Kreislauf-Systems erlangt aufgrund der steigenden Anzahl an kardiovaskulären Erkrankungen zunehmende Bedeutung. Eine Möglichkeit, welche erkrankte Strukturen in ihrer Gesamtheit unter Erhalt der Funktionalität und Bewahrung der morphologischen Eigenschaften ersetzen könnte, ist Bestand des Forschungsgebiets des kardiovaskulären Tissue Engineerings (TE). Entscheidendes Merkmal der tissue-engineerten Konstrukte ist deren Vitalität: Dabei sind es vitale Zellen, welche ein funktionelles und morphologisch ähnliches Ersatzgewebe auf Trägermaterialien bilden. Dieses Ersatzgewebe ermöglicht im Idealfall Wachstum, Regeneration und Entwicklung des Konstruktes zu gesundem, kardiovaskulärem Gewebe. Diese Arbeit analysiert die Bildung extrazellulärer Matrix (EZM) auf einem Polyurethan (PU)-Trägermaterial unter Vergleich unterschiedlicher Besiedelungs- und Konditionierungsregime. Humane Endothelzellen (EC) und Fibroblasten (FB) konnten aus Vena saphena magna-Segmenten enzymatisch isoliert werden. Vorab wurden vier Gruppen (G1 - G4) à fünf tubulären PU-Scaffolds (Durchmesser = 3,3 cm) bestimmt. Zunächst wurden die PU-Scaffolds aller Gruppen für 24 Stunden mit FB (750.000 Zellen/cm2) dynamisch besiedelt und folgend für drei Tage statisch kultiviert. Anschließend konnten die PU-Scaffolds zweier Gruppen zusätzlich mit EC (750.000/cm2) für 24 Stunden dynamisch besiedelt und für drei Tage statisch kultiviert werden. Im Anschluss an die Besiedelungsprozesse wurden die PU-Scaffolds für sieben Tage entweder statisch kultiviert oder dynamisch konditioniert. Die dynamische Konditionierung erfolgte in einem Bioreaktor unter Anwendung eines pulsatilen Flusses mit einer initialen Flussrate von 690 ml/min, welche nach drei Tagen auf 2.100 ml/min erhöht wurde. Entnommene Proben konnten mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM), Live/Dead®- (LD), Immunfluoreszenz- (IF) und histologischen Färbungen sowie quantitativer Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (rt-PCR) analysiert werden. Nach statischer Kultivierung und dynamischer Konditionierung wurden pH-Wert-Messungen des Mediums durchgeführt. Die REM-Analyse bestätigte das Vorhandensein einer Zellschicht auf dem PU-Material. In den LD-Färbungen aller Proben war die Mehrheit der Zellen vital. Die Anwesenheit von FB und EC bestätigte der Nachweis von TE-7 (FB-spezifisch) und von-Willebrand-Faktor (vWF; EC-spezifisch) in IF-Färbungen. Weitere IF- und histologische Färbungen ergaben die Anwesenheit von EZM-Bestandteilen: Elastin, Fibronectin sowie Kollagene. Eine EC-Besiedlung mit dynamischer Konditionierung förderte die Bildung von EZM-Bestandteilen. PU als synthetisches Trägermaterial sowie humane FB und EC eigneten sich für den vorliegenden Versuchsansatz. Die Exposition der Zellen gegenüber dem pulsatilen Fluss im Bioreaktor provozierte die Entstehung von EZM-Bestandteilen. Insgesamt führten sowohl dynamische Besiedelungs- als auch dynamische Konditionierungsprozesse zu einer verbesserten Zellmorphologie und damit zu einer gesteigerten EZM-Bildung. Im Vergleich waren weniger EZM-Bestandteile in den statisch kultivierten Proben nachzuweisen. Die zusätzliche Beschichtung mit EC wirkte sich positiv auf die Bildung der EZM aus. Die FB-Schicht stellte eine optimale Grundlage für die EC-Adhäsion dar. Die alleinige Besiedelung der PU-Scaffolds mit FB führte zu einem Ablösen der Zellen und damit zu einer reduzierten EZM-Bildung. In Hinblick auf die weltweit hohe Mortalität kardiovaskulärer Erkrankungen ist die Regeneration von Gefäßen und Myokard sowie die Herstellung von tissue-engineerten Herzklappen (TEHV = engl. tissue-engineered heart valve) von besonderem klinischen Interesse. Fortschritte auf dem Gebiet des kardiovaskulären TE können zum zukünftigen Ersatz von dysfunktionalem Gewebe einen entscheidenden Beitrag leisten.