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TRPA1-Kationenkanäle. Expression und Funktion als Sauerstoffsensoren in Epithelzellen des respiratorischen Systems
TRPA1-Kationenkanäle. Expression und Funktion als Sauerstoffsensoren in Epithelzellen des respiratorischen Systems
The Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) channel as a member of the TRP-family habors several so called ankyrin repeats in its amino-terminus. Moreover, the channel is composed of intracellular termini and six transmembrane domains with a pore-forming unit between domain 5 and 6 like all other TRP channels. Four TRPA1 monomers build a functional non-selective cation channel, which was characterized as a cellular sensor protein for chemical warfare agents like the sulfur mustard derivate 2-Chloroethylethylsulfid (CEES). Furthermore, lack of oxygen (hypoxia) and excess of oxygen (hyperoxia) activates TRPA1 channels, as shown in vitro and in vivo in neuronal tissues. On a molecular basis, chemical modifications of amino acids like cysteines in or outside of the ankyrin repeats of the channel are induced by chemicals or oxygen, respectively. TRPA1 protein was initially also identified in lung epithelium. However, its expression in non-neuronal tissues of the respiratory tract is due to antibodies of unknown specificity a matter of debate and its function in these tissues is elusive. Therefore, TRPA1-specific mRNAs and proteins were identified in non-neuronal tissues of the respiratory tract after isolation of tracheal and alveolar epithelial cells in this thesis using direct mRNA quantification (Nanostring® technology) and specific TRPA1 antibodies. A small but detectable amount of TRPA1 mRNA was identified in tracheal and alveolar (alveolar type I (ATI) and alveolar type II (ATII)) epithelial cells and TRPA1 protein was verified in ATII cells. Moreover, TRPA1-deficient lung and epithelial cells from the respiratory tract were isolated from TRPA1-/- mice to compare edema formation or increases in intracellular Ca2+ content after application of chemical stimuli like oxygen or sulfur mustard derivates with wild-type (WT) lungs or cells. Methods like the isolated perfused lung for quantification of edema formation and Ca2+ imaging in alveolar, bronchial and tracheal epithelial cells were established in the laboratory. Intracellular Ca2+ content was increased after application of hypoxic and hyperoxic solutions in tracheal bronchial, ATI and ATII cells. TRPA1-deficient hypoxic cells however, showed a significantly lower increase than control cells. To clarify the role of TRPA1 channels in hyperoxia-induced alveolar hyperplasia, WT and TRPA1-deficient mice were housed in climate chambers with excess oxygen. However, no differences in thickening of alveolar septae was detected in the different genotypes. In isolated perfused lungs similar amounts of edema formation were detected after application of ischemia in both genotypes, while TRPA1-deficient lungs exposed significantly larger edemas after application of the sulfur mustard derivate CEES than control lungs. Further experiments to clarify the role of TRAP1 channels as sensors for oxygen and sulfur mustard in non-neuronal tissues must follow, before these channels are considered as pharmacological targets for therapeutic interventions after toxic injury., Der „Transient Receptor Potential Ankyrin 1“ (TRPA1) Kanal zeichnet sich als Mitglied der TRP-Familie durch eine größere Zahl an sog. „Ankyrin-Repeats“ im Aminoterminus aus. Ansonsten besitzt er wie alle anderen TRP-Kanäle intrazelluläre Termini und sechs Transmembrandomänen mit einem Poren-bildenden Bereich zwischen der Domäne fünf und sechs. Vier TRPA1-Monomere bilden einen funktionsfähigen unselektiven Kationenkanal, der als vielseitiges zelluläres Sensorprotein auch für chemische Kampfstoffe wie Lost-Derivate charakterisiert wurde. Außerdem zeichnet sich der TRPA1-Kanal besonders durch seine Aktivierung durch Sauerstoffmangel (Hypoxie) und durch Sauerstoffüberschuss (Hyperoxie) aus, die in-vitro und in-vivo in neuronalen Geweben beschrieben wurde. Dabei werden auf molekularer Ebene Aminosäuren, z.B. Cysteine in den „Ankyrin-Repeats“, durch toxische Chemikalien oder an den Termini durch veränderte Sauerstoffkonzentrationen kovalent modifiziert. TRPA1-Protein wurde auch initial im Lungenepithel durch fluoreszenzgekoppelte TRPA1-Antikörper nachgewiesen. Seine Expression in nicht-neuronalen Geweben des Respirationstrakts gilt jedoch durch Verwendung von Antikörpern unbekannter Spezifität als nicht gesichert. Auch über seine Funktion in diesen Geweben als Sensor ist wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden TRPA1-spezifische mRNAs- und Proteine in frisch isolierten nicht-neuronalen epithelialen Zellen des Respirationstrakts eindeutig nachgewiesen. Dazu wurde eine Methode zur direkten Quantifizierung von TRPA1-mRNA (Nanostring®-Technologie) und spezifische TRPA1-Antikörper zur Identifizierung TRPA1-exprimierender Gewebe genutzt. Mit Hilfe dieser Techniken konnte eine geringe TRPA1-mRNA-Expression in trachealen Epithelzellen und alveolären (alveoläre TypI (ATI) und TypII (ATII)) Zellen nachgewiesen werden. Außerdem wurde TRPA1-Protein mit einem spezifischen Antikörper in ATII-Zellen identifiziert. Darüber hinaus wurden aus einem globalen TRPA1-defizienten (TRPA1-/-) Mausmodell TRPA1-freie Lungen sowie Epithelzellen des Respirationstrakts entnommen, um die Bildung eines Lungenödems oder den zellulären Ca2+-Einstrom nach Applikation chemischer Reize, wie Sauerstoff oder Halb-Lost, mit TRPA1-exprimierenden sog. Wild-Typ-(WT)-Lungen oder -Zellen vergleichen zu können. Zu diesem Zweck wurden das Modell der isolierten perfundierten Mauslunge für die Quantifizierung von Lungenödemen sowie die Methode zur zellulären Ca2+-Einstrom-Messung in alveoläre, bronchiale und tracheale Epithelzellen etabliert. Nach Applikation hypoxischer und hyperoxischer Lösung konnten in Ca2+-Einstrom-Experimenten Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration in primären trachealen, bronchialen Epithelzellen und ATII-Zellen von WT und TRPA1-defizienten Mäusen quantifiziert werden. Mit Hypoxie behandelte TRPA1-defiziente Zellen zeigten aber einen signifikant schwächeren intrazellulären Ca2+-Einstrom im Vergleich zu den WT-Zellen. Um die Rolle des TRPA1-Kanals in der Hyperoxie-induzierten alveolären Hyperplasie zu untersuchen, wurden WT und TRPA1-/- Mäuse in Kammern mit Sauerstoffüberschuss gehalten. Es konnten jedoch keine Unterschiede in den charakteristischen Verdickungen der alveolären Septen zwischen den Genotypen beobachtet werden. Im Modell der isolierten perfundierten Lunge wurden ebenfalls keine Unterschiede in der Ödembildung nach Applikation von Ischämie festgestellt, während TRPA1-defiziente Lungen eine deutlich stärkere Ödembildung nach Applikation von Halb-Lost (2-Chloroethylethylsulfid (CEES)) als Kontrolllungen zeigten. Weitere Experimente zur Rolle von TRPA1 als Sauerstoffsensor und Experimente für die Detektion von chemischen Kampfstoffen in nicht neuronalen Geweben wären notwendig, damit der Kanal eindeutig als pharmakologische Zielsubstanz für die Therapie toxischer Schäden identifiziert werden kann.
TRPA1
Kannler, Martina
2019
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Kannler, Martina (2019): TRPA1-Kationenkanäle: Expression und Funktion als Sauerstoffsensoren in Epithelzellen des respiratorischen Systems. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

The Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) channel as a member of the TRP-family habors several so called ankyrin repeats in its amino-terminus. Moreover, the channel is composed of intracellular termini and six transmembrane domains with a pore-forming unit between domain 5 and 6 like all other TRP channels. Four TRPA1 monomers build a functional non-selective cation channel, which was characterized as a cellular sensor protein for chemical warfare agents like the sulfur mustard derivate 2-Chloroethylethylsulfid (CEES). Furthermore, lack of oxygen (hypoxia) and excess of oxygen (hyperoxia) activates TRPA1 channels, as shown in vitro and in vivo in neuronal tissues. On a molecular basis, chemical modifications of amino acids like cysteines in or outside of the ankyrin repeats of the channel are induced by chemicals or oxygen, respectively. TRPA1 protein was initially also identified in lung epithelium. However, its expression in non-neuronal tissues of the respiratory tract is due to antibodies of unknown specificity a matter of debate and its function in these tissues is elusive. Therefore, TRPA1-specific mRNAs and proteins were identified in non-neuronal tissues of the respiratory tract after isolation of tracheal and alveolar epithelial cells in this thesis using direct mRNA quantification (Nanostring® technology) and specific TRPA1 antibodies. A small but detectable amount of TRPA1 mRNA was identified in tracheal and alveolar (alveolar type I (ATI) and alveolar type II (ATII)) epithelial cells and TRPA1 protein was verified in ATII cells. Moreover, TRPA1-deficient lung and epithelial cells from the respiratory tract were isolated from TRPA1-/- mice to compare edema formation or increases in intracellular Ca2+ content after application of chemical stimuli like oxygen or sulfur mustard derivates with wild-type (WT) lungs or cells. Methods like the isolated perfused lung for quantification of edema formation and Ca2+ imaging in alveolar, bronchial and tracheal epithelial cells were established in the laboratory. Intracellular Ca2+ content was increased after application of hypoxic and hyperoxic solutions in tracheal bronchial, ATI and ATII cells. TRPA1-deficient hypoxic cells however, showed a significantly lower increase than control cells. To clarify the role of TRPA1 channels in hyperoxia-induced alveolar hyperplasia, WT and TRPA1-deficient mice were housed in climate chambers with excess oxygen. However, no differences in thickening of alveolar septae was detected in the different genotypes. In isolated perfused lungs similar amounts of edema formation were detected after application of ischemia in both genotypes, while TRPA1-deficient lungs exposed significantly larger edemas after application of the sulfur mustard derivate CEES than control lungs. Further experiments to clarify the role of TRAP1 channels as sensors for oxygen and sulfur mustard in non-neuronal tissues must follow, before these channels are considered as pharmacological targets for therapeutic interventions after toxic injury.

Abstract

Der „Transient Receptor Potential Ankyrin 1“ (TRPA1) Kanal zeichnet sich als Mitglied der TRP-Familie durch eine größere Zahl an sog. „Ankyrin-Repeats“ im Aminoterminus aus. Ansonsten besitzt er wie alle anderen TRP-Kanäle intrazelluläre Termini und sechs Transmembrandomänen mit einem Poren-bildenden Bereich zwischen der Domäne fünf und sechs. Vier TRPA1-Monomere bilden einen funktionsfähigen unselektiven Kationenkanal, der als vielseitiges zelluläres Sensorprotein auch für chemische Kampfstoffe wie Lost-Derivate charakterisiert wurde. Außerdem zeichnet sich der TRPA1-Kanal besonders durch seine Aktivierung durch Sauerstoffmangel (Hypoxie) und durch Sauerstoffüberschuss (Hyperoxie) aus, die in-vitro und in-vivo in neuronalen Geweben beschrieben wurde. Dabei werden auf molekularer Ebene Aminosäuren, z.B. Cysteine in den „Ankyrin-Repeats“, durch toxische Chemikalien oder an den Termini durch veränderte Sauerstoffkonzentrationen kovalent modifiziert. TRPA1-Protein wurde auch initial im Lungenepithel durch fluoreszenzgekoppelte TRPA1-Antikörper nachgewiesen. Seine Expression in nicht-neuronalen Geweben des Respirationstrakts gilt jedoch durch Verwendung von Antikörpern unbekannter Spezifität als nicht gesichert. Auch über seine Funktion in diesen Geweben als Sensor ist wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden TRPA1-spezifische mRNAs- und Proteine in frisch isolierten nicht-neuronalen epithelialen Zellen des Respirationstrakts eindeutig nachgewiesen. Dazu wurde eine Methode zur direkten Quantifizierung von TRPA1-mRNA (Nanostring®-Technologie) und spezifische TRPA1-Antikörper zur Identifizierung TRPA1-exprimierender Gewebe genutzt. Mit Hilfe dieser Techniken konnte eine geringe TRPA1-mRNA-Expression in trachealen Epithelzellen und alveolären (alveoläre TypI (ATI) und TypII (ATII)) Zellen nachgewiesen werden. Außerdem wurde TRPA1-Protein mit einem spezifischen Antikörper in ATII-Zellen identifiziert. Darüber hinaus wurden aus einem globalen TRPA1-defizienten (TRPA1-/-) Mausmodell TRPA1-freie Lungen sowie Epithelzellen des Respirationstrakts entnommen, um die Bildung eines Lungenödems oder den zellulären Ca2+-Einstrom nach Applikation chemischer Reize, wie Sauerstoff oder Halb-Lost, mit TRPA1-exprimierenden sog. Wild-Typ-(WT)-Lungen oder -Zellen vergleichen zu können. Zu diesem Zweck wurden das Modell der isolierten perfundierten Mauslunge für die Quantifizierung von Lungenödemen sowie die Methode zur zellulären Ca2+-Einstrom-Messung in alveoläre, bronchiale und tracheale Epithelzellen etabliert. Nach Applikation hypoxischer und hyperoxischer Lösung konnten in Ca2+-Einstrom-Experimenten Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration in primären trachealen, bronchialen Epithelzellen und ATII-Zellen von WT und TRPA1-defizienten Mäusen quantifiziert werden. Mit Hypoxie behandelte TRPA1-defiziente Zellen zeigten aber einen signifikant schwächeren intrazellulären Ca2+-Einstrom im Vergleich zu den WT-Zellen. Um die Rolle des TRPA1-Kanals in der Hyperoxie-induzierten alveolären Hyperplasie zu untersuchen, wurden WT und TRPA1-/- Mäuse in Kammern mit Sauerstoffüberschuss gehalten. Es konnten jedoch keine Unterschiede in den charakteristischen Verdickungen der alveolären Septen zwischen den Genotypen beobachtet werden. Im Modell der isolierten perfundierten Lunge wurden ebenfalls keine Unterschiede in der Ödembildung nach Applikation von Ischämie festgestellt, während TRPA1-defiziente Lungen eine deutlich stärkere Ödembildung nach Applikation von Halb-Lost (2-Chloroethylethylsulfid (CEES)) als Kontrolllungen zeigten. Weitere Experimente zur Rolle von TRPA1 als Sauerstoffsensor und Experimente für die Detektion von chemischen Kampfstoffen in nicht neuronalen Geweben wären notwendig, damit der Kanal eindeutig als pharmakologische Zielsubstanz für die Therapie toxischer Schäden identifiziert werden kann.