Necroptosis and apoptosis in the primate ovary

Bagnjuk, Konstantin (2020): Necroptosis and apoptosis in the primate ovary. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

The ovary is one of the most dynamic organs in the human body, bearing resting, developing and dying follicles as well as the corpus luteum (CL). This is a temporary endocrine gland, which develops after ovulation, produces hormones (e.g. progesterone), but eventually regresses. Accordingly, controlled cell death events in ovarian follicles and the CL are inevitably for reproduction and, consequently, make life feasible. However, the underlying mechanisms of cell death in the human ovary mostly remain elusive. One reason for this lack of knowledge is the poor accessibility of translational models. Human luteinized granulosa cells (LGCs) from patients undergoing in vitro fertilization (IVF) are assumed to offer a good model for the primate CL. LGCs produce progesterone during the first days of culture. Eventually, they lose this ability and die like their counterparts in vivo. While apoptosis represents one way for the CL to die, necroptosis – a form of programmed cell death (PCD) – was recently discovered in LGC culture as another possibility. The present work manifests necroptosis in the CL of humans, common marmosets (Callithrix jacchus) and rhesus macaques (Macaca mulatta) in situ. In the latter it was only evident in the late stages, suggesting necroptosis during luteal regression. Resemblance of transcriptomic and proteomic data of in vivo derived monkey CL and in vitro cultured human LGCs, confirmed these cells as a suitable model. Interestingly, both datasets demonstrated coherent upregulation of the ceramide (CER, N-acyl-sphingosine) salvage pathway over culture and in the late CL. Recently, CER was shown to induce necroptosis in other cellular systems. Consistently, the addition of a synthetical analog of this lipid to the LGC culture led to elevated signs of necroptosis in the present study. Furthermore, the pharmacological reduction of the cellular CER content indicated the opposite effect by improving LGC viability. In contrast to follicular granulosa cells (GCs) in vivo, isolated LGCs do not proliferate in culture. Subsequently, these cells are inappropriate to study necroptosis during follicle development. 3D-cultured monkey follicles are well suited to discover mechanisms in dividing follicular GCs. With the present work, necroptosis was verified in this system and blocking the aforementioned type of PCD was shown to improve follicular growth. Further exploring in this setting, the trophic action of acetylcholine was confirmed, which represents a substantial local signaling factor within the ovary. During follicular development, many follicles grow but only one becomes mature. The other follicles eventually become atretic and perish. In some rare settings, the cell death events involved are evaded by degenerated GCs. A consequence can be the development of granulosa cell tumors (GCT), for which surgery has so far been the only effective treatment method. The idea to “trick” the endogenous inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) by analogs of the second mitochondria-derived activator of caspases (SMAC) yields new treatment options. In the present work, heterogenous expression of the IAP machinery in GCTs and a model cell line (KGN) was confirmed and apoptosis was successfully induced by the SMAC mimetic BV6 in this cell line. Collectively, the data suggest necroptosis as a physiological event during follicular development, as well as in luteal regression, and link the latter to the CER salvage pathway. Further, a proof of concept that SMAC mimetics are capable to induce apoptosis in a GCT cell line is provided. In the future, these findings might help patients suffering from GCTs, improve IVF outcome by opposing luteal dysfunction or render targets for fertility control by affecting CL lifetime.

Abstract

Das Ovar ist eines der dynamischsten Organe im menschlichen Körper. Es enthält neben den ruhenden, wachsenden und sterbenden Follikeln auch das corpus luteum (CL). Dieses ist eine temporäre endokrine Drüse, die nach dem Eisprung entsteht, um Hormone (z.B. Progesteron) zu produzieren. Im Laufe des Zyklus bildet sich das CL jedoch wieder zurück. Demnach sind die kontrollierten Zelltodvorgänge, die die ovariellen Follikel und das CL regulieren, unausweichlich für die Fortpflanzung, die wiederum das Leben überhaupt erst möglich macht. Nichtsdestotrotz sind die Mechanismen, die im menschlichen Ovar für diese Vorgänge verantwortlich sind, weitestgehend unbekannt. Ein Grund für diese Wissenslücke ist der Mangel an Modellen, die auf den Menschen übertragbar sind. Es wird angenommen, dass humane luteinisierte Granulosazellen (LGCs) von Patientinnen, die sich einer künstlichen Befruchtung (IVF) unterziehen, ein gutes Modell für das CL von Primaten darstellen. Während der ersten Tage in Kultur produzieren LGCs Progesteron, schließlich verlieren sie diese Fähigkeit jedoch und sterben, genau wie ihr Gegenstück in vivo. Während die Apoptose ein bereits bekannter Zelltodmechanismus im CL ist, kam vor kurzem mit der Entdeckung der Nekroptose – einer Form des programmierten Zelltods (PCD) – in der LGC Kultur eine weitere Möglichkeit auf. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch in den CL von Menschen, Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) und Rhesusaffen (Macaca mulatta) Nekroptose vorkommt. Bei der zuletzt genannten Spezies war diese Zelltodform nur im späten CL ersichtlich, was bedeuten könnte, dass Nekroptose eine Rolle während der Luteolyse spielt. Die Ähnlichkeit zwischen den Transkriptomdaten von in vivo gereiften Affen CL und den Proteomdaten von in vitro kultivierten LGCs bestätigte dabei die gute Übertragbarkeit des verwendeten Modellsystems. Interessanterweise war in beiden Datensätzen der Ceramid (CER, N-Acyl-Sphingosin) Recycling Signalweg sowohl über die Kulturzeit als auch im späten CL hochreguliert. Vor kurzem wurde in anderen zellulären Systemen gezeigt, dass CER Nekroptose auslöst. Damit übereinstimmend führte die Zugabe eines synthetischen Analogons dieses Lipids zur LGC Kultur in der vorliegenden Arbeit zu mehr Nekroptose. Im Gegensatz dazu verbesserte die pharmakologische Senkung des zellulären CER Spiegels die Vitalität der LGCs. Anders als die follikulären Granulosazellen (GCs) in vivo, teilen sich isolierte LGCs nicht in Kultur. Aus diesem Grund ist dieses Modell ungeeignet, um die Nekroptose während der Follikelentwicklung zu studieren. Im Gegensatz dazu stellen 3D kultivierte Affenfollikel ein passendes Modell dar, um die Mechanismen in sich teilenden, follikulären GCs zu verstehen. In der vorliegenden Arbeit konnte in diesem Modellsystem Nekroptose nachgewiesen werden und gleichzeitig gezeigt werden, dass das Blockieren dieses PCD zu verbessertem Follikelwachstum führt. Zusätzlich konnte die trophische Aktivität von Acetylcholin, einem wichtigen Signalfaktor im Ovar, bestätigt werden. Während der Follikelentwicklung wachsen viele Follikel, jedoch reift nur ein einzelner zum Graafschen Follikel heran. Die anderen werden atretisch und sterben schließlich. In seltenen Fällen umgehen entartete GCs jedoch den damit verbundenen Zelltod, was dazu führen kann, dass sich ein Granulosazelltumor (GCT) entwickelt. Derzeit gilt die operative Entfernung des GCTs als die einzige kurative Behandlungsmaßnahme. Die Idee künstliche sekundäre mitochondriale Caspase-Aktivatoren (SMAC) einzusetzen, um endogene Apoptose-Inhibitor-Proteine (IAPs) „auszutricksen“, liefert neue Behandlungsmöglichkeiten. In der aktuellen Arbeit konnte gezeigt werden, dass die IAP-Maschinerie sowohl heterogen in GCTs als auch in einer Modellzelllinie (KGN) exprimiert wird und dass Apoptose in KGN durch das SMAC-Mimetikum BV6 ausgelöst werden kann. Die vorliegende Arbeit legt den Schluss nahe, dass Nekroptose ein physiologisches Ereignis während der Follikelentwicklung und der Luteolyse ist und dass der zuletzt genannte Prozess in Verbindung mit dem CER-Signalweg steht. Zusätzlich wird der Machbarkeitsnachweis dafür geliefert, dass SMAC-Mimetika in der Lage sind, Apoptose in einer GCT-Zellline auszulösen. Zukünftig könnten diese Ergebnisse genutzt werden, um GCT-Patientinnen zu helfen, die IVF-Erfolgschancen durch die Bekämpfung der lutealen Dysfunktion zu erhöhen oder um neue Zielmoleküle für die Schwangerschaftsverhütung zu liefern, die die Lutealphase verkürzen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Necroptosis, Apoptosis, Ovary, Corpus luteum, Cell death
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 8. Januar 2020
• 1. Bericht­erstatter:in: Kunz, Lars