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Der Einfluss von 12/15-Lipoxygenase-Hemmung und Tacrolimus-Behandlung auf die Glutathionperoxidase-4-abhängige Signalkaskade im hepatischen Ischämie-Reperfusionsschaden
Der Einfluss von 12/15-Lipoxygenase-Hemmung und Tacrolimus-Behandlung auf die Glutathionperoxidase-4-abhängige Signalkaskade im hepatischen Ischämie-Reperfusionsschaden
Hintergrund In Zeiten des Organmangels, in denen vermehrt marginale Spenderorgane zur Transplantation akzeptiert werden, steht die Erforschung potentieller Mechanismen der Verbesserung von Organqualität und Verlängerung von Transplantatüberleben im Vordergrund. Der hepatische Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) stellt hierbei eine der zentralen Komplikationen nach Lebertransplantationen dar, weil er das Organüberleben signifikant einschränkt. Der hepatische IRI entsteht durch die Ausbildung von oxidativem Stress nach der Gewebsreperfusion, ist charakterisiert durch ein komplexes Zusammenspiel aus Mikrozirkulationsstörung, zellulärer Immunantwort, sowie proinflammatorischen Mediatoren und mündet in unterschiedlichen Formen des Zelltods. In den letzten Jahren konnte die Relevanz der Glutathion-peroxidase-4 (Gpx4) -abhängigen Signalkaskade, in welcher die 12/15-Lipoxygenase (12/15-LOX) als Lipidperoxidquelle einen oxidativen Zelltodinitiator darstellt, im IRI anderer Organsysteme nachgewiesen werden. Jedoch konnten die genauen Wirkmechanismen und Zelltodmediatoren der Gpx4-abhängigen Signalkaskade bisher noch nicht vollständig geklärt werden. Zudem wurde das etablierte Immunsuppressivum und Calcineurininhibitor Tacrolimus in den vergangenen Jahren immer wieder mit einer Wirkung auf den Glutathionmetabolismus in Verbindung gebracht, wenngleich auch hier die genaue Interaktion nicht endgültig beschrieben werden konnte. Ziel dieser Studie war daher, die Relevanz der Gpx4-abhängigen Signalkaskade für den hepatischen IRI zu erörtern, neue Erkenntnisse über potentielle Mediatormechanismen zu erlangen und die Interaktion dieser Signalkaskade mit Tacrolimus zu beleuchten. Methoden An Lebern von C57BL/6-Mäusen wurde unter peritoneal applizierter Narkose operativ ein hepatischer IRI induziert, indem der gemeinsame Pedikel des rechten anterioren, linken an-terioren und linken posterioren Lebersegments für 60 Minuten abgeklemmt wurde, was eine 65%ige Leberischämie zur Folge hatte. In der weiteren Folge erfolgte eine 90-minütige Reperfusionsphase. Die verschiedenen Versuchstiere wurden entsprechend ihrer Experimentalgruppe ohne medikamentöse Vorbehandlung untersucht, beziehungsweise nach 30-minütiger Vorbehandlung mit Baicalein, einem potenten Hemmstoff der 12/15-LOX, und der Trägerlösung von Baicalein, DMSO. Zudem wurde eine Versuchsgruppe 24 Stunden vor Laparotomie mit Tacrolimus vorbehandelt, sowie eine Versuchsgruppe kombiniert mit Tacrolimus und Baicalein. Das Gewebe der postischämischen Lebersegmente wurden hin-sichtlich des Zelltodausmaßes mittels TUNEL-Assay quantifiziert, bezüglich der proapoptotischen Proteine ERK1/2, JNK, PARP und Caspase-3 mithilfe von Western Blot-Analysen analysiert und für die Bestimmung der Glutathionextinktion spektralphotometrisch untersucht. Ferner erfolgten eine laborchemische Auswertung der Mausseren zum Ende des Experiments in Bezug auf Leber- und Nierenparameter, sowie eine kontinuierliche, intraarterielle Kreislaufüberwachung. Für sämtliche Versuchsgruppen wurden zudem scheinoperierte Kontrollgruppen anhand derselben Verfahren untersucht. Ergebnisse Die Analyse der TUNEL-Assays ergab eine signifikante Abnahme abgestorbener Zellen nach IRI-Induktion und Vorbehandlung mit Baicalein (-74,8%; p<0,001), Tacrolimus (-61,8%; p<0,01) und der kombinierten Vortherapie mit beiden Medikamenten (-62,3%; p<0,001). Nach alleiniger DMSO-Therapie konnte zumindest ein negativer Regulationstrend hinsichtlich der Zelltodabnahme festgestellt werden (-23,2%). Die Western Blot-Analysen ergaben eine tendenzielle Minderexpression von ERK1/2 nach Baicalein- (-36,8%), Tacrolimus- (-19,1%) und Kombinationstherapie (-28,1%), sowie eine signifikante Abnahme der Aktivität von JNK durch Baicalein- (-83,0%; p<0,01), DMSO- (-69,7%; p<0,05) und Tacrolimusgabe (-84,6%; p<0,05), von PARP durch Baicalein- (-73,8%; p<0,05), DMSO- (-68,9%; p<0,05) und Kombinationstherapie (-80,1%; p<0,05), wie auch von Caspase-3 nach Baicalein- (-45,0%; p<0,001), Tacrolimus- (-66,9%; p<0,001) und kombinierter Applikation (-59,2%; p<0,001). Ein negativer Regulationstrend der PARP-Aktivität konnte auch nach Tacrolimusgabe verzeichnet werden (-59,9%). Zudem war eine signifikante Steigerung des oxidativen Glutathionmetabolismus nach Baicalein- (+45,7%; p<0,05), Tacrolimus- (+75,1%; p<0,05) und kombinierter Therapie (+43,7%; p<0,05) festzustellen. Während allein die Gabe von Baicalein, DMSO oder der Kombinationstherapie zu einer signifikant gesteigerten Ausschüttung der Transaminasen und GLDH ins Blut führte, konnte eine relative Abnahme der postischäm erfassten Laborwerte nach Baicalein- (GOT -56,4%; p<0,001; GPT: -16,8%; GLDH -62,1%; p<0,001), DMSO- (GOT -36,5%; p<0,01; GPT -43,7%; p<0,001; GLDH -40,0%; p<0,001), Tacrolimus- (GOT -28,8%; p<0,05; GPT -53,4%; p<0,001; GLDH -3,4%) und der Kombinationstherapie (GOT -64,4%; p<0,001; GPT -10,4%; GLDH -47,1%; p<0,001), größtenteils signifikant, gemessen werden. Schlussfolgerung Die Vorbehandlung mit Baicalein führt zu einer signifikanten Zelltodabnahme nach hepatischem IRI, sowie zu einer signifikanten Steigerung der Glutathionoxidierung. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass die Gpx4-abhängige Signalkaskade eine relevante Rolle im hepatischen IRI zu spielen scheint. Diese hepatoprotektiven Effekte werden durch die signifikante Reduktion der JNK-, PARP- und Caspase-3-Aktivität, sowie durch eine tendenzielle Abnahme der ERK1/2-Aktivität bewirkt, welche somit relevante Zelltodmediatoren in der Gpx4-abhängigen Signalkaskade zu sein scheinen. Auch eine Tacrolimustherapie hat ähnliche Auswirkungen auf die Zelltodentwicklung und den Glutathionmetabolismus zur Folge, während sie dieselben Zelltodmediatoren in vergleichbarer Weise affektiert. Somit ist zu mutmaßen, dass auch Tacrolimus seine postischäm hepatoprotektiven Eigenschaften durch die Interaktion mit dem Gpx4-Signalweg erhält. Ebenso scheint die als Antioxidans bekannte Trägerlösung DMSO in weitaus diskreterem Ausmaß als die anderen beschriebenen Substanzen Teile der dargestellten Signalketten des oxidativen Glutathionstoffwechsels positiv zu beeinflussen. Eine Kombinationstherapie aus Tacrolimus und Baicalein konnte jedoch keine Steigerung der jeweiligen Therapieeffekte erbringen. Dies ist am ehesten auf die nachgewiesenen, relevanten toxischen Effekte der Einzelsubstanzen auf Zelltod, Leberwerte im Serum und Kreislaufparameter zurückzuführen, welche im postischämischen Umfeld jedoch durch die protektiven Effekte amortisiert zu sein schienen. Baicalein und Tacrolimus stellen somit potentielle Therapieansätze zur Reduktion des hepatischen IRI dar, sofern ein sinnvolles Maß an Protektivität im Vergleich zur Toxizität erlangt werden kann.
Not available
Drefs, Moritz
2019
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Drefs, Moritz (2019): Der Einfluss von 12/15-Lipoxygenase-Hemmung und Tacrolimus-Behandlung auf die Glutathionperoxidase-4-abhängige Signalkaskade im hepatischen Ischämie-Reperfusionsschaden. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Hintergrund In Zeiten des Organmangels, in denen vermehrt marginale Spenderorgane zur Transplantation akzeptiert werden, steht die Erforschung potentieller Mechanismen der Verbesserung von Organqualität und Verlängerung von Transplantatüberleben im Vordergrund. Der hepatische Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) stellt hierbei eine der zentralen Komplikationen nach Lebertransplantationen dar, weil er das Organüberleben signifikant einschränkt. Der hepatische IRI entsteht durch die Ausbildung von oxidativem Stress nach der Gewebsreperfusion, ist charakterisiert durch ein komplexes Zusammenspiel aus Mikrozirkulationsstörung, zellulärer Immunantwort, sowie proinflammatorischen Mediatoren und mündet in unterschiedlichen Formen des Zelltods. In den letzten Jahren konnte die Relevanz der Glutathion-peroxidase-4 (Gpx4) -abhängigen Signalkaskade, in welcher die 12/15-Lipoxygenase (12/15-LOX) als Lipidperoxidquelle einen oxidativen Zelltodinitiator darstellt, im IRI anderer Organsysteme nachgewiesen werden. Jedoch konnten die genauen Wirkmechanismen und Zelltodmediatoren der Gpx4-abhängigen Signalkaskade bisher noch nicht vollständig geklärt werden. Zudem wurde das etablierte Immunsuppressivum und Calcineurininhibitor Tacrolimus in den vergangenen Jahren immer wieder mit einer Wirkung auf den Glutathionmetabolismus in Verbindung gebracht, wenngleich auch hier die genaue Interaktion nicht endgültig beschrieben werden konnte. Ziel dieser Studie war daher, die Relevanz der Gpx4-abhängigen Signalkaskade für den hepatischen IRI zu erörtern, neue Erkenntnisse über potentielle Mediatormechanismen zu erlangen und die Interaktion dieser Signalkaskade mit Tacrolimus zu beleuchten. Methoden An Lebern von C57BL/6-Mäusen wurde unter peritoneal applizierter Narkose operativ ein hepatischer IRI induziert, indem der gemeinsame Pedikel des rechten anterioren, linken an-terioren und linken posterioren Lebersegments für 60 Minuten abgeklemmt wurde, was eine 65%ige Leberischämie zur Folge hatte. In der weiteren Folge erfolgte eine 90-minütige Reperfusionsphase. Die verschiedenen Versuchstiere wurden entsprechend ihrer Experimentalgruppe ohne medikamentöse Vorbehandlung untersucht, beziehungsweise nach 30-minütiger Vorbehandlung mit Baicalein, einem potenten Hemmstoff der 12/15-LOX, und der Trägerlösung von Baicalein, DMSO. Zudem wurde eine Versuchsgruppe 24 Stunden vor Laparotomie mit Tacrolimus vorbehandelt, sowie eine Versuchsgruppe kombiniert mit Tacrolimus und Baicalein. Das Gewebe der postischämischen Lebersegmente wurden hin-sichtlich des Zelltodausmaßes mittels TUNEL-Assay quantifiziert, bezüglich der proapoptotischen Proteine ERK1/2, JNK, PARP und Caspase-3 mithilfe von Western Blot-Analysen analysiert und für die Bestimmung der Glutathionextinktion spektralphotometrisch untersucht. Ferner erfolgten eine laborchemische Auswertung der Mausseren zum Ende des Experiments in Bezug auf Leber- und Nierenparameter, sowie eine kontinuierliche, intraarterielle Kreislaufüberwachung. Für sämtliche Versuchsgruppen wurden zudem scheinoperierte Kontrollgruppen anhand derselben Verfahren untersucht. Ergebnisse Die Analyse der TUNEL-Assays ergab eine signifikante Abnahme abgestorbener Zellen nach IRI-Induktion und Vorbehandlung mit Baicalein (-74,8%; p<0,001), Tacrolimus (-61,8%; p<0,01) und der kombinierten Vortherapie mit beiden Medikamenten (-62,3%; p<0,001). Nach alleiniger DMSO-Therapie konnte zumindest ein negativer Regulationstrend hinsichtlich der Zelltodabnahme festgestellt werden (-23,2%). Die Western Blot-Analysen ergaben eine tendenzielle Minderexpression von ERK1/2 nach Baicalein- (-36,8%), Tacrolimus- (-19,1%) und Kombinationstherapie (-28,1%), sowie eine signifikante Abnahme der Aktivität von JNK durch Baicalein- (-83,0%; p<0,01), DMSO- (-69,7%; p<0,05) und Tacrolimusgabe (-84,6%; p<0,05), von PARP durch Baicalein- (-73,8%; p<0,05), DMSO- (-68,9%; p<0,05) und Kombinationstherapie (-80,1%; p<0,05), wie auch von Caspase-3 nach Baicalein- (-45,0%; p<0,001), Tacrolimus- (-66,9%; p<0,001) und kombinierter Applikation (-59,2%; p<0,001). Ein negativer Regulationstrend der PARP-Aktivität konnte auch nach Tacrolimusgabe verzeichnet werden (-59,9%). Zudem war eine signifikante Steigerung des oxidativen Glutathionmetabolismus nach Baicalein- (+45,7%; p<0,05), Tacrolimus- (+75,1%; p<0,05) und kombinierter Therapie (+43,7%; p<0,05) festzustellen. Während allein die Gabe von Baicalein, DMSO oder der Kombinationstherapie zu einer signifikant gesteigerten Ausschüttung der Transaminasen und GLDH ins Blut führte, konnte eine relative Abnahme der postischäm erfassten Laborwerte nach Baicalein- (GOT -56,4%; p<0,001; GPT: -16,8%; GLDH -62,1%; p<0,001), DMSO- (GOT -36,5%; p<0,01; GPT -43,7%; p<0,001; GLDH -40,0%; p<0,001), Tacrolimus- (GOT -28,8%; p<0,05; GPT -53,4%; p<0,001; GLDH -3,4%) und der Kombinationstherapie (GOT -64,4%; p<0,001; GPT -10,4%; GLDH -47,1%; p<0,001), größtenteils signifikant, gemessen werden. Schlussfolgerung Die Vorbehandlung mit Baicalein führt zu einer signifikanten Zelltodabnahme nach hepatischem IRI, sowie zu einer signifikanten Steigerung der Glutathionoxidierung. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass die Gpx4-abhängige Signalkaskade eine relevante Rolle im hepatischen IRI zu spielen scheint. Diese hepatoprotektiven Effekte werden durch die signifikante Reduktion der JNK-, PARP- und Caspase-3-Aktivität, sowie durch eine tendenzielle Abnahme der ERK1/2-Aktivität bewirkt, welche somit relevante Zelltodmediatoren in der Gpx4-abhängigen Signalkaskade zu sein scheinen. Auch eine Tacrolimustherapie hat ähnliche Auswirkungen auf die Zelltodentwicklung und den Glutathionmetabolismus zur Folge, während sie dieselben Zelltodmediatoren in vergleichbarer Weise affektiert. Somit ist zu mutmaßen, dass auch Tacrolimus seine postischäm hepatoprotektiven Eigenschaften durch die Interaktion mit dem Gpx4-Signalweg erhält. Ebenso scheint die als Antioxidans bekannte Trägerlösung DMSO in weitaus diskreterem Ausmaß als die anderen beschriebenen Substanzen Teile der dargestellten Signalketten des oxidativen Glutathionstoffwechsels positiv zu beeinflussen. Eine Kombinationstherapie aus Tacrolimus und Baicalein konnte jedoch keine Steigerung der jeweiligen Therapieeffekte erbringen. Dies ist am ehesten auf die nachgewiesenen, relevanten toxischen Effekte der Einzelsubstanzen auf Zelltod, Leberwerte im Serum und Kreislaufparameter zurückzuführen, welche im postischämischen Umfeld jedoch durch die protektiven Effekte amortisiert zu sein schienen. Baicalein und Tacrolimus stellen somit potentielle Therapieansätze zur Reduktion des hepatischen IRI dar, sofern ein sinnvolles Maß an Protektivität im Vergleich zur Toxizität erlangt werden kann.