Site-specific bioorthogonal modification of antibodies and T cell receptor ligands for use in cancer therapy and research

Stengl, Andreas (2019): Site-specific bioorthogonal modification of antibodies and T cell receptor ligands for use in cancer therapy and research. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Cancer is a tremendously heterogeneous and dynamic disease and for that reason challenging to treat. Classical, broad-spectrum therapies like surgery, radiation, chemotherapy and combinations thereof contributed greatly to increased life expectancy of cancer patients. The universality of these therapies makes them applicable for a broad range of cancer types and patients but comes along with the risk of severe side effects or diminished efficacy. The desire for cancer-type-specific drugs and patient- personalized therapies has spurred the development of novel therapeutic concepts. Two very prominent targeted concepts, both inspired by the immune system, are antibody based drugs and immune cell therapy. Antibodies form the structural basis for multiple therapeutic molecules. Three salient formats are addressed in this thesis, namely antiproliferative monoclonal antibodies, bispecific antibodies and antibody-drug conjugates (ADCs). First, a high content assay for parallel investigation of antiproliferative potency and mode of action combining base-analog incorporation and DNA content quantification is described. Second, Tub-tag mediated C-terminal protein- protein-ligation (TuPPL) using complementary click-chemistry handles is demonstrated as a convenient method for bispecific antibody generation. Especially screening of bispecific antibody pairs could be streamlined by combinatorial linkage of individual candidates after protein production. Modification of proteins after expression is currently promoted by the advance of bioorthogonal conjugation strategies. Modification of endogenous amino acids, incorporation of unnatural amino acids and enzymatic modification are widely used for the introduction of universal bioorthogonal handles or direct attachment of functional groups. Along this line, a novel cysteine selective modular bioconjugation method using phosphonamidate electrophiles to generate stable cysteine conjugates is described here. The method was further applied to stably attach cytotoxic drug molecules to antibodies. The resulting ADCs show promising in vitro as well as in vivo efficacy and increased serum stability compared to standard maleimide conjugation. Although antibody based drugs indeed open the therapeutic window by lowering off-target effects as well as increasing tumor specific toxicity they still face limitations. Degradation and systemic clearance of the biomolecule require administration in regular intervals and tissue penetrance is limited by passive diffusion. In contrast, the use of cells as “living drugs” is a revolutionary new concept bypassing some limitations of “dead drugs”. The use of tumor specific immune cells, especially T cells, for cancer therapy shows promising results, however, the “living” nature of these drugs requires thorough characterization of the cell product. Along this line a novel T cell characterization agent, called FLEXamer, is described in this thesis that allows isolation and characterization of antigen specific T cells and associated T cell receptors. FLEXamers retain the high precision of conventional multimer reagents but unite the individual multimers in a single versatile reagent that can be functionalized on demand for the specific need. Taken together this work presents site-specific conjugation methods and novel sensitive tools for production and comprehensive characterization of sensitive and patient-specific next-generation cancer therapeutics.

Abstract

Die Behandlung von Krebs stellt Wissenschaftler vor eine große Herausforderung, da es sich um eine sehr heterogene und dynamische Erkrankung handelt. Mit klassischen Methoden wie operativen Eingriffen, Bestrahlung, Chemotherapie und deren Kombination konnte die Lebenserwartung von Krebspatienten deutlich verlängert werden. Diese Therapieoptionen sind zwar über ein weites Spektrum an Krebserkrankungen einsetzbar, jedoch birgt die geringe Spezifität ein hohes Risiko für Nebenwirkungen oder verminderte Wirksamkeit. Der Wunsch nach Therapeutika, die eine höhere Spezifität für die unterschiedlichen Krebsarten aufweisen und gleichzeitig eine personalisierte Behandlung des einzelnen Patienten erlauben, hat die Entwicklung von neuen therapeutischen Konzepten vorangetrieben. Zwei aktuelle Konzepte, die beide Komponenten des Immunsystems als Grundlage nutzen, sind antikörperbasierte Wirkstoffe und Immunzelltherapie. Antikörper bilden den strukturellen Kern bei einer Vielzahl von therapeutischen Molekülen. Wachstumshemmende monoklonale Antikörper, bispezifische Antikörper und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate stellen hierbei die drei Hauptformate dar und werden in dieser Arbeit adressiert. Zuerst wird ein high-content Verfahren beschrieben, welches den Einbau von DNA-Basenanaloga und anschließende Quantifizierung des DNA-Gehalts nutzt, um das Potential eines wachstumshemmenden Antikörpers zu bestimmen. Zusätzlich ermöglicht es Einblicke in dessen Wirkmechanismus zu gewinnen. Ferner wird der Einbau komplementärer Klick-Gruppen mittels Tub-tag Konjugation zur C-terminalen Verknüpfung von Proteinen beschrieben und dessen Eignung zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern demonstriert. Vor allem bei der Selektion von geeigneten Antikörperpaaren bietet eine solch modulare Ligationsmethode die Möglichkeit viele Kandidaten kombinatorisch zu verknüpfen nachdem sie individuell exprimiert wurden, um so komfortabel eine Bibliothek von bispezifischen Molekülen zu generieren. Im Allgemeinen wird durch die Entwicklung und Optimierung einer Vielzahl von bioorthogonaler Konjugationsmethoden die Modifikation von Proteinen aktuell stark vorangetrieben. Weit verbreitet ist die Modifikation von endogenen natürlichen Aminosäuren, der Einbau von unnatürlichen Aminosäuren und die enzymatische Modifikation, um entweder direkt eine funktionelle Einheit anzuheften oder um universelle bioorthogonale Gruppen einzubringen. In diesem Zusammenhang wird in dieser Arbeit eine neue cystein-selektive, modulare Biokonjugationsmethode beschrieben, die elektrophile Phosphonamidate verwendet, um stabile Cysteinkonjugate herzustellen. Ferner wird diese Methode zur stabilen Verknüpfung von cytotoxischen Molekülen und Antikörpern verwendet. Die daraus resultierenden Antikörper- Wirkstoff-Konjugate sind sowohl in vitro als auch in vivo aktiv und zeigen darüber hinaus eine erhöhte Plasmastabilität im Verglichen zur standardmäßigen Maleimidkonjugation. Antikörperbasierte Wirkstoffe erweitern zwar wie erwartet das therapeutische Fenster indem sie off-target Effekte reduzieren und zugleich tumor- spezifische Toxizität erhöhen, stoßen jedoch auch auf Limitationen. Biomoleküle werden aktiv abgebaut und aus dem Körper entfernt und erfordern somit eine wiederholte Verabreichung des Therapeutikums in regelmäßigen Zeitabständen. Außerdem ist die Verteilung im Körper hauptsächlich durch passive Effekte bestimmt, wodurch die Penetration in das Gewebe erschwert wird. Im Gegensatz hierzu steht der revolutionär neue Ansatz “lebendige Medikamente” zu verwenden, die aktiv im Körper proliferieren, und somit Limitationen von “leblosen Medikamenten” umgehen. Vielversprechend zeigt sich hier der Einsatz von Immunzellen, allen voran von T Zellen für die Krebstherapie. Die “lebendige” Natur dieser zellbasierten Medikamente erfordert jedoch eine umfassende Charakterisierung bevor sie dem Patienten verabreicht werden. In diesem Zusammenhang wird in dieser Arbeit ein neues Multimerreagenz, namens FLEXamer, zur Isolierung und Charakterisierung von T Zellen und deren T Zellrezeptoren beschrieben. FLEXamere erhalten die hohe Präzision von konventionellen Multimerreagenzien, vereinen jedoch die unterschiedlichen Multimere in einem einzigen vielseitigen Reagenz, das bedarfsgerecht, individuell funktionalisiert werden kann. Zusammenfassend beschäftigt sich diese Arbeit mit ortsgerichteten Biokonjugationsmethoden und neuen sensitiven Werkzeugen zur Herstellung und umfassenden Charakterisierung von sensitiven und patientenspezifischen Krebstherapeutika der nächsten Generation.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 11. Dezember 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Leonhardt, Heinrich