ORM-like protein (ORMDL) - Annäherung an die Funktion über die Interaktion

Klingbeil, Julian (2019): ORM-like protein (ORMDL) - Annäherung an die Funktion über die Interaktion. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) ist die Identifikation von Assoziationen zwischen Krankheiten und Allelen im gesamten Genom möglich. Die Beurteilung der Relevanz identifizierter Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP), das bessere Verständnis der Pathogenese der assoziierten Erkrankung und die Identifikation neuer Therapieansätze erfolgt jedoch über die Kenntnis der Funktion des durch die Genmutation in Struktur, Menge oder Funktionalität veränderten Proteins. Ein Beispiel hierfür ist die 2007 erstmals beschriebene Assoziation zwischen kindlichem Asthma bronchiale und dem Genlocus von ORM-like protein 3 (ORMDL3) auf dem Chromosomenabschnitt 17q21, die bei unbekannter ORMDL-Funktion zunächst zu keinem Erkenntnisgewinn hinsichtlich der Pathogenese oder Therapie von Asthma führte. Asthma ist die häufigste chronische Erkrankung der Atemwege im Kindesalter, doch bisher stehen, auch aufgrund der noch unzureichend verstandenen Pathogenese, nur symptomatische Therapien zur Verfügung. Ziel dieser Arbeit war es, mittels Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) Protein-Protein-Interaktionen (PPI) der ORMDL-Proteinfamilie zu identifizieren, um aus dem dadurch entstehenden explorativen Interaktom Rückschlüsse auf die Funktion der ORMDL-Proteine zu ziehen. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Interaktion zwischen ORMDL und dem β2-Adrenorezeptor (β2-AR) genauer analysiert werden. Im ersten Teil der Arbeit wurden für die Erstellung eines Interaktoms von ORMDL1, ORMDL2 und ORMDL3 mittels BRET insgesamt 471 PPI untersucht, wobei hypothesengetrieben Interaktionspartner aus verschiedenen zellulären Funktionssystemen geprüft wurden. Es gelang der Nachweis einer Homo- und Heterooligomerisierung aller ORMDL-Proteine. Zudem wurden PPI zwischen ORMDL und humanen Homologen von in Saccharomyces cerevisiae bekannten Interaktionspartnern untersucht. Hier konnten aus 21 untersuchten PPI 12 positive identifiziert werden, darunter mit wichtigen Proteinen der Cholesterin- und Sphingolipidbiosynthese. Zudem wurde untersucht, ob ORMDL mit Membranrezeptoren interagiert. Hier waren 33 von 39 PPI positiv. Unter den immunologisch relevanten Proteinen waren 19 der 51 PPI positiv.Weiterhin wurde untersucht, ob ORMDL mit wichtigen Chaperonproteinen sowie Proteinen des Calciumstoffwechsels interagiert, wobei 47 von 81 PPI positiv waren. Von 7 untersuchten Proteinen des γ-Sekretase-Komplexes interagierten 6 mit allen ORMDL-Proteinen. Eine Testung gegen das peroxisomale Proteom ergab schließlich bei 126 getesteten PPI 24 positive. Insgesamt waren 45,4 % der 366 in den hypothesengetriebenen Untersuchungen geprüften PPI positiv. In einem Kontrollexperiment mit Testung auf eine Interaktion von ORMDL1, ORMDL2 oder ORMDL3 mit 35 zufällig ausgewählten Proteinen aus der in der eigenen Arbeitsgruppe etablierten cDNA-Bank waren es hingegen nur 1,9 %. Zusammenfassend konnten 168 PPI, davon über 155 erstmals, nachgewiesen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Interaktion von ORMDL mit einem neu identifizierten Interaktionspartner, dem β2-AR, genauer charakterisiert. Wir verifizierten die Interaktion mittels Co-IP und konnten mittels BRET zeigen, dass ORMDL3 β2-AR mit signifikant höherer Affnität bindet als ORMDL1 oder ORMDL2. Die Affnität von ORMDL3 zu β2-AR hing dabei vom β2-AR-Allelstatus ab und ließ sich durch Zugabe von in der Asthmatherapie relevanten β-Sympathomimetika beeinflussen. Aufgrund der ER-Lokalisation der ORMDL-Proteine und der zuvor nachgewiesenen Interaktionen mit Membranproteinen und Chaperonen untersuchten wir schließlich, ob ORMDL3 möglicherweise als akzessorisches Protein einen Einfluss auf die Oberflächenexpression von β2-AR ausübt. Im In-Cell/On-Cell ELISA konnte gezeigt werden, dass die Koexpression von ORMDL3 die Menge des an der Zelloberfläche lokalisierten β2-AR erhöht. Der Nachweis von Homo- und Heterooligomeren von ORMDL stärkt die Hinweise auf eine Assoziation auch von ORMDL1 und ORMDL2 und damit der gesamten ORMDL-Proteingruppe mit kindlichem Asthma und ist Teil einer Publikation, in der auch eine Assoziation von Polymorphismen der Promotorregionen von ORMDL1 und ORMDL2 mit der Erkrankung an Asthma nachgewiesen werden konnten. Auch der Nachweis eines beinahe identischen Interaktoms für ORMDL1, ORMDL2 und ORMDL3 deutet auf eine gemeinsame Funktion und eine gemeinsame Assoziation mit Asthma hin. Insgesamt zeigt das explorative Interaktom, dass die ORMDL-Proteine als date hub Proteine mit komplexen Funktionen im endoplasmatischen Retikulum fungieren könnten. Die hypothesengestriebenen Untersuchungen bestätigen zugleich Interaktionen mit Proteinen des Calciumhaushalts, der Alzheimerpathogenese und der Spingholipidsynthese. Für diese Prozesse ist mittlerweile eine Beteiligung von ORMDL belegt. Der erstmalige Nachweis von Interaktionen zwischen den ORMDL-Proteinen und immunologisch relevanten Proteinen wie auch zahlreichen Membranrezeptoren, darunter der β2-AR, macht zudem eine direktere Assoziation zwischen Asthma und ORMDL möglich. ORMDL3 zeigte einen Einfluss auf die Oberflächenexpression eines Membranrezeptors (β2-AR) und seine Interaktion mit β2-AR wird wiederum durch β-Sympathomimetika und die in der Pharmakogenetik von Asthma relevanten β2-AR-Allele G16/Q27, R16/Q27 und G16/E27 beeinflusst. Dies ist ein neuer Ansatz für das Verständnis der Komplexen ORMDL-Funktionen. Die Relevanz der gezeigten PPI mit Membranrezeptoren und insbesondere β-AR in der Krankheitsentstehung von Asthma wird durch weitere Untersuchungen der funktionellen Auswirkungen dieser Interaktionen geprüft.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: ORMDL, BRET, PPI, ADRB2, Interaktom
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 10. Oktober 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Muntau, Ania Carolina