An in vitro and in vivo study on the function of Signal Peptide Peptidase-Like 2c and 3

Papadopoulou, Alkmini (2019): An in vitro and in vivo study on the function of Signal Peptide Peptidase-Like 2c and 3. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Perfect synthesis and function of proteins is needed for optimal survival of an organism. Specific protein functions are dictated not only by the amino acid sequence of a protein but also from other factors, including post-translational modifications such as glycosylation, and the localisation of a protein. The hydrolysation of a protein’s peptide bonds is termed proteolysis and is performed by proteases. The purpose of proteolysis can vary from activation to degradation of a protein. Although in most cases proteolysis occurs in a hydrophilic environment, a specific subtype of proteases called intramembrane proteases, is capable of hydrolysing peptide bonds in the hydrophobic environment of a cellular membrane. This ability makes these proteases, that are polytopic membrane proteins, both very interesting and quite hard to study. Signal-Peptide-Peptidase (SPP) and Signal-Peptide-Peptidase-Like proteins (SPPLs) are a family of intramembrane proteases that compirse a conserved active site located in a GxGD motif. Hence, SPP and SPPLs are members of the GxGD family of intramembrane proteases together with the presenilins, which are well studied due to their crucial role in the pathology of Alzheimer’s disease. Five members compose the SPP/SPPL family in mammals, SPP, SPPL2a, SPPL2b, SPPL2c, and SPPL3, with generally a few less members being present in different organisms. From the five members, SPPL3 and especially SPPL2c were the least understood until recently. For SPPL3, it was shown previously that it has the ability to process full-length glycosidases and glycosyltransferases in vitro and in vivo, leading to a reduction of glycosylation of cellular glycoproteins. In the first part of this study, the amino acid sequence of two SPPL3 substrates, N-acetylglucosaminyltransferase V (GnTV) and exostosin-like glycosyltransferase 3 (EXTL3), is analysed by introducing mutations to identify amino acids crucial for recognition and cleavage by SPPL3. Within the transmembrane (TM) domain (TMD) of GnTV, the presence of two glycines in a GxxxG motif appears to play a role for cleavage, and further destabilisation of the TM a-helix by introducing a proline at either glycine site increases processing by SPPL3, however not all results for this motif are consistent. Mutating the amino acids surrounding the previously identified cleavage site of GnTV and a similar location on the EXTL3 sequence causes a shift to a SPPL3-independent cleavage for both substrates. The protease responsible for the cleavage of the mutants remains elusive. The second part of the study focuses on the in vivo function of SPPL3 initially through the analysis of a SPPL3 deficient mouse line. SPPL3 knockout is only supported in a mixed background mouse line. Apart from some deficits in the mating of knockout mice and a reduced motor activity present in old knockout mice (>12 months), the main phenotype observed is a severe reduction in the adipose tissue of the SPPL3 deficient mice. To analyse this phenotype further, SPPL3 knockout mouse embryonic stem cells (SPPL3 KO ESCs) were generated with the CRISPR/Cas9 system and were then differentiated to adipocytes in vitro. The results from the ESCs follow the same tendencies as observed in the mice with a very low number of adipose cells at the end of the differentiation period for the SPPL3 KO ESCs compared to control cells, suggesting involvement of SPPL3 in the formation and/or function of mature adipocytes. The last part of this study focuses on the purpose of the least understood member of the family, SPPL2c. Since its discovery, SPPL2c was considered a pseudoprotease due to the lack of substrates in vitro, while protein levels could not be detected in vivo. After successfully demonstrating that SPPL2c is indeed expressed in vivo in the testis of humans and mice, this study effectively identifies and validates physiological substrates of SPPL2c (Niemeyer et al. 2019, Papadopoulou et al. 2019). It also demonstrates that SPPL2c can affect vesicular trafficking and holds a physiological role in the maturation of spermatozoa. Taken together, this study focuses on two members of the SPP/SPPL family, SPPL3 and SPPL2c, and analyses them both in vivo and in vitro revealing new characteristics and physiological implications of the proteases. The knowledge this work provides is important not only in the context of these two proteins, but also for the general understanding of the mechanism and purpose of intramembrane proteolysis.

Abstract

Die optimale Funktion von Proteinen ist für das bestmögliche Überleben eines Organismus entscheidend. Spezifische Funktionen werden nicht nur durch die Aminosäuresequenz eines Proteins definiert, sondern auch durch verschiedene andere Faktoren wie Glykosylierung und subzelluläre Lokalisierung des Proteins. Außerdem regulieren proteolytische Spaltungen diverse physiologische Prozesse und steuern beispielsweise durch Aktivierung und Abbau die Funktionen von Proteinen. Proteolyse bezeichnet die Hydrolyse der Peptidbindungen eines Proteins. Enzyme, die diese Reaktion katalysieren, werden als Proteasen bezeichnet. Obwohl Proteolyse bevorzugt in hydrophilen Umgebungen stattfindet, kann ein spezifischer Subtyp von Proteasen, die Intramembranproteasen, Peptidbindungen innerhalb einer Zellmembran hydrolysieren. Das macht diese polytopischen Intramembranproteasen sehr interessant, aber auch schwer zu untersuchen. Die Signal-Peptid-Peptidase (SPP) und Signal-Peptid-Peptidase-like Proteine (SPPLs) bilden eine Intramembranprotease-Familie. Das aktive Zentrum, das durch ein GxGD-Motiv charakterisiert ist, ist innerhalb dieser und der Presenilin-Familie hoch konserviert. Die Presinilin-Familie ist aufgrund ihrer entscheidenden Rolle in der Pathologie der Alzheimer-Krankheit gut untersucht und bildet zusammen mit den SPP/SPPL-Proteasen die Klasse der GxGD-Intramembran-Aspartyl-Proteasen. Die SPP/SPPL-Familie umfasst in Säugetieren die fünf Mitglieder SPP, SPPL2a, SPPL2b, SPPL2c und SPPL3. SPPL3 und vor allem SPPL2c sind die bis dato am wenigsten untersuchten Mitglieder dieser Protease-Familie. Für SPPL3 konnte gezeigt werden, dass es die Fähigkeit besitzt, Glykosidasen und Glykosyltransferasen in vitro und in vivo zu hydrolysieren, was zu einer reduzierten Protein-Glykosylierung führt. Im ersten Teil dieser Studie wird versucht durch gezielte Mutation der Aminosäuresequenz von zwei bekannten SPPL3-Substraten, N-Acetylglukosaminyltransferase V (GnTV) und Exostosin-like-Glycosyltransferase 3 (EXTL3), das für die Prozessierung durch SPPL3 entscheidenden Erkennungsmotiv zu identifizieren. Die beiden Glyzine innerhalb eines GxxxG-Motiv in der Transmembrandomäne (TMD) von GnTV scheinen eine wichtige Rolle für seine Spaltung zu spielen. Insbesondere eine Destabilisierung der a-Helix in der TMD durch den Austausch eines Glyzins gegen ein Prolin beschleunigt die Prozessierung von GnTV durch SPPL3. Umgekehrt führt in einigen Fällen aber auch die Stabilisierung der Helix in diesem Bereich zu einer beschleunigten Prozessierung von GnTV, sodass sich derzeit kein schlüssiges Gesamtbild ergibt. Mutationen im Bereich der zuvor identifizierten SPPL3-Spaltstelle von GnTV, sowie an einer vergleichbaren Stelle in der EXTL3-Sequenz, führen zu einer SPPL3-unabhängigen Spaltung beider Substrate. Die Protease, die für die Spaltung dieser Mutanten verantwortlich ist, konnte bisher nicht identifiziert werden. Der zweite Teil dieser Studie konzentriert sich auf die Analyse einer Sppl3-defizienten Mauslinie zur Aufklärung der in vivo-Funktion von SPPL3. Überlebensfähige Tiere mit einem SPPL3-Knockout konnten ausschließlich in einer Mauslinie mit gemischtem genetischen Hintergrund generiert werden. Diese SPPL3-defizienten Tiere zeigen neben einer reduzierten Geburtenrate und verringerter motorischer Aktivität, die insbesondere in älteren Tieren (> 12 Monate) beobachtet wird eine starke Reduktion des Fettgewebes. Zur weiteren Analyse dieses Phänotyps wurden SPPL3-defiziente embryonale Maus-Stammzellen (ESC) mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems generiert und anschließend zu Adipozyten differenziert. Am Ende der Differenzierungsperiode wird im Vergleich zu Kontrollzellen eine verringerte Anzahl von Adipozyten in SPPL3-Knockout ESC beobachtet. Diese Beobachtung legt nahe, dass SPPL3 an der Bildung und Funktion gereifter Adipozyten beteiligt ist. Der letzte Teil dieser Studie konzentriert sich auf die Funktion des am wenigsten untersuchten Familienmitglieds SPPL2c. Seit seiner Entdeckung wurde aufgrund des fehlenden Nachweises von Substraten und Proteinexpression angenommen, dass SPPL2c eine Pseudoprotease ist. Nach dem erfolgreichen Nachweis, dass das SPPL2c Protein tatsächlich in vivo in menschlichen und murinen Hoden exprimiert wird, werden in dieser Studie physiologische Substrate von SPPL2c identifiziert und validiert. Es wird außerdem nachgewiesen, dass SPPL2c den vesikulären Transport beeinflussen kann und unter physiologischen Bedingungen an der Reifung von Spermatozoen beteiligt ist (Niemeyer et al. 2019, Papadopoulou et al. 2019). Zusammengefasst konzentriert sich diese Studie auf zwei Mitglieder der SPP/SPPL-Familie, SPPL3 und SPPL2c, und analysiert diese sowohl in vivo als auch in vitro. Dabei werden neue Eigenschaften und physiologische Funktionen der Proteasen beschrieben. Das neu gewonnene Wissen ist nicht nur im Zusammenhang mit diesen beiden Proteinen wichtig, sondern auch für das allgemeine Verständnis des Mechanismus und der Funktion der Intramembranproteolyse.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 27. September 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Fluhrer, Regina