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Aktivierung und Funktion von murinem EpCAM in embryonalen Stammzellen
Aktivierung und Funktion von murinem EpCAM in embryonalen Stammzellen
Tumorgenese und Metastasierung sind bestimmt von unkontrollierter Proliferation und Migration. Das dimere Transmembranprotein EpCAM ist stark in Karzinomen exprimiert und spielt eine Rolle bei der Regulation von Proliferation und onkogener Transformation. Darüberhinaus sind murine und humane embryonale Stammzellen vergleichbar stark EpCAM-positiv. Im Verlauf der Differenzierung wird EpCAM herunterreguliert und schlussendlich nur noch von einfachen Epithelien exprimiert. Dieser Unterschied in der Expressionsmenge wirft Fragen nach Regulation und Funktion von EpCAM im pluripotenten Zustand von embryonalen Stammzellen, im Verlauf der frühen Embryogenese und bei der malignen Differenzierung von Tumorzellen auf. In der vorliegenden Arbeit wurde ein 3D Modell der spontanen Differenzierung in Embryoid Bodies verwendet, um die frühe Embryogenese in vitro nachzuahmen und eine genetische Manipulation der Zellen zu ermöglichen. In vorangegangenen Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnte durch eine konstitutive Überexpression von EpCAM ein positiver Einfluss auf die endodermale Differenzierung und eine Hemmung der mesodermalen Differenzierung nachgewiesen werden. Desweiteren wurde eine Interaktion von EpCAM mit der GTPase ERas nachgewiesen. Um verantwortliche molekulare Mechanismen bei der EpCAM-vermittelten Regulation der Differenzierung von Stammzellen zu entschlüsseln, wurde in der vorliegenden Arbeit ERas und hyperaktive AKT (myrAKT) in ES-Zellen überexprimiert. Die Verbindung zwischen EpCAM und dem PI3Kinase/AKT Signalweg über ERas konnte durch eine AKT Phosphorylierung nach Überexpression von EpCAM nachgewiesen werden. Nach ERas und myrAKT Überexpression wurde eine Hemmung der kardiomyozytären Differenzierung beobachtet. Dies spricht dafür, dass die mesodermale Differenzierung durch EpCAM-ERas-PI3-Kinase/AKT partiell gehemmt wird. Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal ein konstitutiver EpCAM-Knockout mit Hilfe der CRISPR Cas9 Technologie in embryonalen Stammzellen durchgeführt. In EpCAM-negativen embryonalen Stammzellen reduzierte sich die AKT Phosphorylierung auf 30 % des Ausgangswerts in parentalen Stammzellen. Ein zellulärer EpCAM-Knockout zeigte keine Proliferationsnachteile, die embryonalen Stammzellen differenzierten in alle drei Keimblätter. Dies wurde durch Analyse der mRNA früher Keimblattmarkern nach zehntägiger Differenzierung in Embryoid Bodies sowie durch immunhistochemische Färbung von Embryoid Bodies nachgewiesen. Durch den EpCAM-Knockout zeigte sich jedoch erneut eine Hemmung der kardiomyozytären Differenzierung. Erste Versuche zeigten eine partielle Rekonstitution der kardiomyozytären Differenzierung der EpCAM-negativen embryonalen Stammzellen durch die Anwesenheit von ursprünglich EpCAM-positiven Stammzellen in Embryoid Bodies. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass für eine korrekte kardiomyozytäre Differenzierung modulierende Interaktion von EpCAM-positiven endodermalen und EpCAM-negativen mesodermalen Zellen via juxtakriner Zellkommunikation notwendig ist. Eine Störung des streng regulierten Gleichgewichts der EpCAM Expression beeinträchtigt die spontane mesodermale Differenzierung. In der frühen Entwicklungsphase ist eine ausbalancierte EpCAM Expression auf Einzell- und Zellclusterniveau für die Differenzierung zu Kardiomyozyten essentiell sowie es aus dem French Flag Modell der Entwicklung bekannt ist. Da EpCAM onkogen und proliferativ in Karzinomen wirkt, wurde ein Teratom bzw. Teratokarzinomassay mit EpCAM und ERas Überexpressionszellen sowie EpCAM Knockout Zellen durchgeführt. EpCAM beeinflusste die Tumorigenität von embryonalen Stammzellen nicht. Eine erste immunhistochemische Analyse der EpCAM-Knockout Teratome erbrachte eine Tendenz der Zellentwicklung im Teratom in Richtung mesodermaler Differenzierung. Diese Analyse könnte durch die Färbung von EC-Zellen durch Oct3/4 und Foxa2 ergänzt werden, um einen Einblick in die Rolle von EpCAM bei der Entstehung von EC-Zellen und bei der endodermalen Differenzierung im Teratom zu bekommen. Im Hinblick auf zukünftige Stammzelltherapien ist es essentiell, Signalwege in embryonalen Stammzellen, die zur Differenzierung und Dedifferenzierung führen, weiter zu entschlüsseln., Tumorigenesis and metastases formation are characterized by uncontrolled proliferation and cell migration. Epithelial cell adhesion molecule EpCAM is a heart-shaped cis-dimer transmembrane protein present at the cell surface, which is highly expressed in various cancers and embryonic stem cells (ESC). In carcinoma cells, EpCAM is involved in proliferation and oncogenic transformation. Expression levels in murine ESCs are comparably high or even higher than in carcinoma cells. In contrast to this, expression of EpCAM in physiological tissue is limited to subsets of epithelia. This difference in expression levels raises questions about the roles of EpCAM in ESCs. To address these questions in the present thesis, the hanging-drop 3D-differentiation model was used to generate embryoid bodies that closely mimics embryogenesis in vitro. Previous work of our group demonstrated gain-of-function of EpCAM as supportive in achieving guided endodermal differentiation, but repressive functions in mesodermal differentiation, as exemplified with cardiomyocyte formation. Furthermore, the small GTPase embryonic Ras (ERas) was identified as novel EpCAM interactor. To gain further insight in molecular pathways of EpCAM-mediated regulation of cell differentiation, ESC clones expressing exogenous ERas and an activated version of AKT (myrAKT) were generated. Over-expression of EpCAM fostered the activating phosphorylation of AKT. Both, over-expression of ERas and the activated version of AKT mimicked limiting effects of EpCAM on cardiomyocyte formation. This is indicative for a novel signaling axis EpCAM/ERas/AKT in ESCs that limits mesodermal differentiation to cardiomyocytes. For the first time, a loss-of-function knockout of EpCAM was generated through CRISPR-Cas9 technology in murine embryonic stem cells. Cellular EpCAM knockout cells showed a decreased AKT phosphorylation but revealed no major impact on ESC proliferation. EpCAM knockout ESC initially differentiated in all three germ layers, as disclosed by quantitative RT-PCR and immunhistochemical analysis of early germ layer markers. However, CRISPR Cas9- guided cellular EpCAM knockout clones were severely impaired in the formation of contracting EB and loss of EpCAM interfered with correct differentiation, measured with elevated transcripts of Oct3/4 and ERas in quantitative RT-PCR. Disturbed mesodermal 3D-differentiation of EpCAM-negative ESCs was partly reverted by the presence of a minor fraction of initially EpCAM-positive wild-type ESCs, which supported full differentiation of knockout ESCs to cardiomyocytes, as visualized upon immune- and direct fluorescence in Embryoid bodies. Together these data disclose modulating interaction of endodermal and mesodermal cell, most probably via juxtacrine signalling. Disturbance of the tight control of EpCAM results in perturbation of spontaneous mesodermal differentiation. It displays a need for spatiotemporally balanced expression of EpCAM at single cell and multicellular organism level for the orchestrated completion of ESC differentiation to cardiomyocytes at the earliest time points of gastrulation. Since EpCAM was reported to regulate cell proliferation and oncogenicity through RIP-dependent signaling in carcinoma cells, a teratoma formation assay was performed. Cellular knockout of EpCAM had no impact on teratoma formation or tumour weight, but immunhistochemical staining of EpCAM -/- teratomas showed a slightly increased fraction of mesodermal cells. Hence, EpCAM is dispensable for teratoma formation. In view of stem cell therapy, it is mandatory to follow up with decoding main pathways and interacting partners of differentiation and dedifferentiation.
EpCAM, Stammzellen, Teratome, CRISPRCas9, embryoid bodies
Fischer, Laura
2019
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Fischer, Laura (2019): Aktivierung und Funktion von murinem EpCAM in embryonalen Stammzellen. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Tumorgenese und Metastasierung sind bestimmt von unkontrollierter Proliferation und Migration. Das dimere Transmembranprotein EpCAM ist stark in Karzinomen exprimiert und spielt eine Rolle bei der Regulation von Proliferation und onkogener Transformation. Darüberhinaus sind murine und humane embryonale Stammzellen vergleichbar stark EpCAM-positiv. Im Verlauf der Differenzierung wird EpCAM herunterreguliert und schlussendlich nur noch von einfachen Epithelien exprimiert. Dieser Unterschied in der Expressionsmenge wirft Fragen nach Regulation und Funktion von EpCAM im pluripotenten Zustand von embryonalen Stammzellen, im Verlauf der frühen Embryogenese und bei der malignen Differenzierung von Tumorzellen auf. In der vorliegenden Arbeit wurde ein 3D Modell der spontanen Differenzierung in Embryoid Bodies verwendet, um die frühe Embryogenese in vitro nachzuahmen und eine genetische Manipulation der Zellen zu ermöglichen. In vorangegangenen Arbeiten unserer Arbeitsgruppe konnte durch eine konstitutive Überexpression von EpCAM ein positiver Einfluss auf die endodermale Differenzierung und eine Hemmung der mesodermalen Differenzierung nachgewiesen werden. Desweiteren wurde eine Interaktion von EpCAM mit der GTPase ERas nachgewiesen. Um verantwortliche molekulare Mechanismen bei der EpCAM-vermittelten Regulation der Differenzierung von Stammzellen zu entschlüsseln, wurde in der vorliegenden Arbeit ERas und hyperaktive AKT (myrAKT) in ES-Zellen überexprimiert. Die Verbindung zwischen EpCAM und dem PI3Kinase/AKT Signalweg über ERas konnte durch eine AKT Phosphorylierung nach Überexpression von EpCAM nachgewiesen werden. Nach ERas und myrAKT Überexpression wurde eine Hemmung der kardiomyozytären Differenzierung beobachtet. Dies spricht dafür, dass die mesodermale Differenzierung durch EpCAM-ERas-PI3-Kinase/AKT partiell gehemmt wird. Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal ein konstitutiver EpCAM-Knockout mit Hilfe der CRISPR Cas9 Technologie in embryonalen Stammzellen durchgeführt. In EpCAM-negativen embryonalen Stammzellen reduzierte sich die AKT Phosphorylierung auf 30 % des Ausgangswerts in parentalen Stammzellen. Ein zellulärer EpCAM-Knockout zeigte keine Proliferationsnachteile, die embryonalen Stammzellen differenzierten in alle drei Keimblätter. Dies wurde durch Analyse der mRNA früher Keimblattmarkern nach zehntägiger Differenzierung in Embryoid Bodies sowie durch immunhistochemische Färbung von Embryoid Bodies nachgewiesen. Durch den EpCAM-Knockout zeigte sich jedoch erneut eine Hemmung der kardiomyozytären Differenzierung. Erste Versuche zeigten eine partielle Rekonstitution der kardiomyozytären Differenzierung der EpCAM-negativen embryonalen Stammzellen durch die Anwesenheit von ursprünglich EpCAM-positiven Stammzellen in Embryoid Bodies. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass für eine korrekte kardiomyozytäre Differenzierung modulierende Interaktion von EpCAM-positiven endodermalen und EpCAM-negativen mesodermalen Zellen via juxtakriner Zellkommunikation notwendig ist. Eine Störung des streng regulierten Gleichgewichts der EpCAM Expression beeinträchtigt die spontane mesodermale Differenzierung. In der frühen Entwicklungsphase ist eine ausbalancierte EpCAM Expression auf Einzell- und Zellclusterniveau für die Differenzierung zu Kardiomyozyten essentiell sowie es aus dem French Flag Modell der Entwicklung bekannt ist. Da EpCAM onkogen und proliferativ in Karzinomen wirkt, wurde ein Teratom bzw. Teratokarzinomassay mit EpCAM und ERas Überexpressionszellen sowie EpCAM Knockout Zellen durchgeführt. EpCAM beeinflusste die Tumorigenität von embryonalen Stammzellen nicht. Eine erste immunhistochemische Analyse der EpCAM-Knockout Teratome erbrachte eine Tendenz der Zellentwicklung im Teratom in Richtung mesodermaler Differenzierung. Diese Analyse könnte durch die Färbung von EC-Zellen durch Oct3/4 und Foxa2 ergänzt werden, um einen Einblick in die Rolle von EpCAM bei der Entstehung von EC-Zellen und bei der endodermalen Differenzierung im Teratom zu bekommen. Im Hinblick auf zukünftige Stammzelltherapien ist es essentiell, Signalwege in embryonalen Stammzellen, die zur Differenzierung und Dedifferenzierung führen, weiter zu entschlüsseln.

Abstract

Tumorigenesis and metastases formation are characterized by uncontrolled proliferation and cell migration. Epithelial cell adhesion molecule EpCAM is a heart-shaped cis-dimer transmembrane protein present at the cell surface, which is highly expressed in various cancers and embryonic stem cells (ESC). In carcinoma cells, EpCAM is involved in proliferation and oncogenic transformation. Expression levels in murine ESCs are comparably high or even higher than in carcinoma cells. In contrast to this, expression of EpCAM in physiological tissue is limited to subsets of epithelia. This difference in expression levels raises questions about the roles of EpCAM in ESCs. To address these questions in the present thesis, the hanging-drop 3D-differentiation model was used to generate embryoid bodies that closely mimics embryogenesis in vitro. Previous work of our group demonstrated gain-of-function of EpCAM as supportive in achieving guided endodermal differentiation, but repressive functions in mesodermal differentiation, as exemplified with cardiomyocyte formation. Furthermore, the small GTPase embryonic Ras (ERas) was identified as novel EpCAM interactor. To gain further insight in molecular pathways of EpCAM-mediated regulation of cell differentiation, ESC clones expressing exogenous ERas and an activated version of AKT (myrAKT) were generated. Over-expression of EpCAM fostered the activating phosphorylation of AKT. Both, over-expression of ERas and the activated version of AKT mimicked limiting effects of EpCAM on cardiomyocyte formation. This is indicative for a novel signaling axis EpCAM/ERas/AKT in ESCs that limits mesodermal differentiation to cardiomyocytes. For the first time, a loss-of-function knockout of EpCAM was generated through CRISPR-Cas9 technology in murine embryonic stem cells. Cellular EpCAM knockout cells showed a decreased AKT phosphorylation but revealed no major impact on ESC proliferation. EpCAM knockout ESC initially differentiated in all three germ layers, as disclosed by quantitative RT-PCR and immunhistochemical analysis of early germ layer markers. However, CRISPR Cas9- guided cellular EpCAM knockout clones were severely impaired in the formation of contracting EB and loss of EpCAM interfered with correct differentiation, measured with elevated transcripts of Oct3/4 and ERas in quantitative RT-PCR. Disturbed mesodermal 3D-differentiation of EpCAM-negative ESCs was partly reverted by the presence of a minor fraction of initially EpCAM-positive wild-type ESCs, which supported full differentiation of knockout ESCs to cardiomyocytes, as visualized upon immune- and direct fluorescence in Embryoid bodies. Together these data disclose modulating interaction of endodermal and mesodermal cell, most probably via juxtacrine signalling. Disturbance of the tight control of EpCAM results in perturbation of spontaneous mesodermal differentiation. It displays a need for spatiotemporally balanced expression of EpCAM at single cell and multicellular organism level for the orchestrated completion of ESC differentiation to cardiomyocytes at the earliest time points of gastrulation. Since EpCAM was reported to regulate cell proliferation and oncogenicity through RIP-dependent signaling in carcinoma cells, a teratoma formation assay was performed. Cellular knockout of EpCAM had no impact on teratoma formation or tumour weight, but immunhistochemical staining of EpCAM -/- teratomas showed a slightly increased fraction of mesodermal cells. Hence, EpCAM is dispensable for teratoma formation. In view of stem cell therapy, it is mandatory to follow up with decoding main pathways and interacting partners of differentiation and dedifferentiation.