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Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics
Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics
Messenger RNA (mRNA) plays a central role in gene regulation. The mRNA is produced in the cell nucleus by transcribing a gene and is afterwards translated into proteins by ribosomes in the cytoplasm. Due to its transient nature, mRNA is a very flexible molecule because it is neither a permanent storage for genetic information nor a functional product. With the help of nanocarriers, synthetic mRNA can be transferred into cells and the translation, the cell-internal production of any protein, can be achieved. Both the mRNA transport process in cells and the translation kinetics are poorly understood. However, these are of great importance for the therapeutic use of mRNAs in nanomedicine. In this thesis, an in vitro assay was developed which enables the measurement of individual single-cell kinetics within a cell population with regard to mRNA nanoparticle transport as well as translation kinetics. The assay is based on time-lapse microscopy of cells on protein-coated microstructured fields, so-called single-cell arrays, for parallel recording of single-cell time courses of the expression kinetics of a fluorescent protein. Protein expression is triggered by the transport of synthetic mRNA into the cell interior. The array was connected to a perfusion system in order to enable the exchange of fluids during observation at the microscope. This made it possible to measure the entire fluorescence protein expression kinetics including the initial phase as a function of a defined time interval of mRNA nanoparticle exposure for the first time. The translation kinetics were obtained by reading out the fluorescence intensity time courses of individual cells on the microstructured fields. In order to quantify the time courses of the translation, different biochemical rate models based on ordinary differential equations were investigated. The model that described the experimental data best was used to determine the kinetic rates per cell. The single cell parameters allowed the determination of the population distribution of each parameter and thus the cell-to-cell variability. In the second part of the study, the precise measurement of single-cell kinetics was used to determine the onset of expression of each cell. This provides information on the duration of the mRNA transport process. Using two model systems, lipofectamine and lipid nanoparticles (LNP), we showed that the duration of mRNA transport does not correlate with the efficiency of transport in individual cells. We were able to show that these parameters change systematically with increasing serum protein concentration. Serum protein adsorption negatively affects both the timing and the efficiency of lipofectamine, whereas it improves the timing and efficiency of LNP-mediated transfection. This is an important finding, as nanoparticles are usually administered via the blood for therapeutic purposes and thus come into contact with serum proteins. The developed assay also represents a new opportunity to quantify the mRNA half-life in living cells. The mRNA half-life is a key parameter of translation regulation and depends, among other things, on the poly(A) tail length. However, how exactly the mRNA half-life depends on the poly(A) tail length has not been quantified. To this end, mRNA constructs with ten different poly(A) lengths were investigated. Based on the measurement results, we formulated a simple model that describes the relationship between poly(A) length and mRNA half-life using a power law function with an exponent of 0.53. If a further fluorescence signal is recorded for the single cell translation assay, additional intracellular correlation studies are possible. This can be used, for instance, to make the mRNA nanoparticles detectable, which makes it possible to measure the time interval between nanoparticle adsorption on the cell surface and the onset of protein expression. Via a degradation-dependent fluorescence labeling of the mRNA, the temporal changes of the mRNA and protein concentration could be measured simultaneously, which would allow for a more accurate resolution of the mRNA degradation with help of the single cell arrays., Die Messenger RNA (mRNA) spielt eine zentrale Rolle in der Genregulation. Diese wird im Zellkern durch das Ablesen eines Gens hergestellt und danach im Zellinneren durch Ribosome in Proteine übersetzt. Die mRNA ist aufgrund ihrer transienten Natur ein sehr flexibles Molekül, da sie weder ein permanenter genetischer Informationsspeicher ist noch ein funktionelles Produkt darstellt. Mit Hilfe von Nanofähren kann synthetische mRNA in Zellen transferiert und die Translation, d.h. die zell-interne Produktion beliebiger Proteine, erreicht werden. Dabei ist sowohl der mRNA Transportprozess in Zellen als auch die Translationskinetik wenig verstanden. Dies hat jedoch große Bedeutung für den therapeutischen Einsatz von mRNAs in der Nanomedizin. In dieser Arbeit wurde ein in vitro Assay entwickelt, der es ermöglicht, individuelle Einzelzellkinetiken innerhalb einer Zellpopulation sowohl bezüglich des mRNA Nanopartikeltransports, als auch der Translationskinetiken zu messen. Der Assay beruht auf Zeitraffermikroskopie von Zellen auf proteinbeschichteten, mikrostrukturierten Feldern, sogenannten Einzelzell-Arrays, zur parallelisierten Aufzeichnung von Einzelzell-Zeitverläufen der Expressionskinetik eines Fluoreszenzproteins. Die Proteinexpression wird dabei durch den Transport von synthetischer mRNA ins Zellinnere ausgelöst. Das Array wurde mit einem Perfusionssystem verbunden, um einen Flüssigkeitsaustausch während der Beobachtung am Mikroskop zu ermöglichen. Dadurch war erstmals die Aufnahme der gesamten Fluoreszenzprotein-Expressionskinetik einschließlich der Anfangsphase in Abhängigkeit eines definierten Zeitintervalls der mRNA Nanopartikelexposition messbar. Die Translationskinetik wurde dabei durch das Auslesen der Fluoreszenzintensitätszeitverläufe einzelner Zellen auf der Mikrostrukturierung erhalten. Um die Zeitverläufe der Translation zu quantifizieren, wurden in dieser Arbeit verschiedene biochemische Raten-Modelle auf der Grundlage gewöhnlicher Differentialgleichungen untersucht. Das Modell, das die experimentellen Daten am besten beschreibt, wurde genutzt, um die kinetischen Raten jeder einzelnen Zelle zu ermitteln. Die Einzelzellparameter ermöglichten dabei die Bestimmung der Populationsverteilung jedes Parameters und damit der Zell-zu-Zell Variabilität. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die präzise Messung von Einzelzellkinetiken genutzt, um den Expressionsbeginn jeder Zelle zu bestimmen. Dieser gibt Auskunft über die Dauer des mRNA Transportprozesses. Wir zeigten anhand von zwei Modellsystemen, Lipofectamine und Lipidnanopartikeln (LNP), dass die Dauer des mRNA Transports nicht mit der Effizienz des Transports in einzelnen Zellen korreliert. Wir konnten zeigen, dass sich diese Parameter in Abhängigkeit steigender Serumproteinkonzentration systematisch ändern. Die Serumproteinadsorption beeinflusst sowohl den Zeitpunkt als auch die Effizienz von Lipofectamine negativ, während sie im Gegensatz dazu den Zeitpunkt und die Effizienz der LNP-vermittelten Transfektion verbessert. Dies spielt für die medizinische Anwendung eine große Rolle da die Nanopartikel üblicherweise über das Blut verabreicht werden und dabei in Kontakt mit Serumproteinen kommen. Der entwickelte Assay stellt zusätzlich eine neue Chance zur Quantifizierung der mRNA Halbwertszeit in lebenden Zellen dar. Die mRNA Halbwertszeit ist ein Schlüsselparameter der Translationsregulation und unter Anderem abhängig von der poly(A) Schwanzlänge. Es ist jedoch nicht quantifiziert, wie genau die mRNA Halbwertszeit von der poly(A) Schwanzlänge abhängt. Zu diesem Zweck wurden mRNA Konstrukte mit zehn unterschiedlichen poly(A) Längen untersucht. Auf Grundlage der Messergebnisse formulierten wir erstmals ein einfaches Modell, das die Beziehung zwischen poly(A) Länge und mRNA Lebenszeit mittels eines Potenzgestezes mit einem Exponenten von 0,53 beschreibt. Nutzt man für den Einzelzell-Translationsassay die Aufnahme eines weiteren Fluoreszenzsignals sind zusätzliche intrazelluläre Korrelationsstudien möglichen. Dies kann beispielsweise eingesetzt werden um die mRNA-Nanopartikel detektierbar zu machen wodurch der zeitliche Abstand zwischen Nanopartikeladsorption an der Zelloberfläche und dem Proteinexpressionsbeginn messbar ist. Durch eine degradationsabhängige Fluoreszenzmarkierung der mRNA könnten zukünftig mit Hilfe der Einzelzellarrays die zeitlichen Veränderungen der mRNA- und Proteinkonzentration zur genaueren Auflösung der mRNA Degradation simultan gemessen werden.
Not available
Reiser, Anita
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Reiser, Anita (2019): Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Messenger RNA (mRNA) plays a central role in gene regulation. The mRNA is produced in the cell nucleus by transcribing a gene and is afterwards translated into proteins by ribosomes in the cytoplasm. Due to its transient nature, mRNA is a very flexible molecule because it is neither a permanent storage for genetic information nor a functional product. With the help of nanocarriers, synthetic mRNA can be transferred into cells and the translation, the cell-internal production of any protein, can be achieved. Both the mRNA transport process in cells and the translation kinetics are poorly understood. However, these are of great importance for the therapeutic use of mRNAs in nanomedicine. In this thesis, an in vitro assay was developed which enables the measurement of individual single-cell kinetics within a cell population with regard to mRNA nanoparticle transport as well as translation kinetics. The assay is based on time-lapse microscopy of cells on protein-coated microstructured fields, so-called single-cell arrays, for parallel recording of single-cell time courses of the expression kinetics of a fluorescent protein. Protein expression is triggered by the transport of synthetic mRNA into the cell interior. The array was connected to a perfusion system in order to enable the exchange of fluids during observation at the microscope. This made it possible to measure the entire fluorescence protein expression kinetics including the initial phase as a function of a defined time interval of mRNA nanoparticle exposure for the first time. The translation kinetics were obtained by reading out the fluorescence intensity time courses of individual cells on the microstructured fields. In order to quantify the time courses of the translation, different biochemical rate models based on ordinary differential equations were investigated. The model that described the experimental data best was used to determine the kinetic rates per cell. The single cell parameters allowed the determination of the population distribution of each parameter and thus the cell-to-cell variability. In the second part of the study, the precise measurement of single-cell kinetics was used to determine the onset of expression of each cell. This provides information on the duration of the mRNA transport process. Using two model systems, lipofectamine and lipid nanoparticles (LNP), we showed that the duration of mRNA transport does not correlate with the efficiency of transport in individual cells. We were able to show that these parameters change systematically with increasing serum protein concentration. Serum protein adsorption negatively affects both the timing and the efficiency of lipofectamine, whereas it improves the timing and efficiency of LNP-mediated transfection. This is an important finding, as nanoparticles are usually administered via the blood for therapeutic purposes and thus come into contact with serum proteins. The developed assay also represents a new opportunity to quantify the mRNA half-life in living cells. The mRNA half-life is a key parameter of translation regulation and depends, among other things, on the poly(A) tail length. However, how exactly the mRNA half-life depends on the poly(A) tail length has not been quantified. To this end, mRNA constructs with ten different poly(A) lengths were investigated. Based on the measurement results, we formulated a simple model that describes the relationship between poly(A) length and mRNA half-life using a power law function with an exponent of 0.53. If a further fluorescence signal is recorded for the single cell translation assay, additional intracellular correlation studies are possible. This can be used, for instance, to make the mRNA nanoparticles detectable, which makes it possible to measure the time interval between nanoparticle adsorption on the cell surface and the onset of protein expression. Via a degradation-dependent fluorescence labeling of the mRNA, the temporal changes of the mRNA and protein concentration could be measured simultaneously, which would allow for a more accurate resolution of the mRNA degradation with help of the single cell arrays.

Abstract

Die Messenger RNA (mRNA) spielt eine zentrale Rolle in der Genregulation. Diese wird im Zellkern durch das Ablesen eines Gens hergestellt und danach im Zellinneren durch Ribosome in Proteine übersetzt. Die mRNA ist aufgrund ihrer transienten Natur ein sehr flexibles Molekül, da sie weder ein permanenter genetischer Informationsspeicher ist noch ein funktionelles Produkt darstellt. Mit Hilfe von Nanofähren kann synthetische mRNA in Zellen transferiert und die Translation, d.h. die zell-interne Produktion beliebiger Proteine, erreicht werden. Dabei ist sowohl der mRNA Transportprozess in Zellen als auch die Translationskinetik wenig verstanden. Dies hat jedoch große Bedeutung für den therapeutischen Einsatz von mRNAs in der Nanomedizin. In dieser Arbeit wurde ein in vitro Assay entwickelt, der es ermöglicht, individuelle Einzelzellkinetiken innerhalb einer Zellpopulation sowohl bezüglich des mRNA Nanopartikeltransports, als auch der Translationskinetiken zu messen. Der Assay beruht auf Zeitraffermikroskopie von Zellen auf proteinbeschichteten, mikrostrukturierten Feldern, sogenannten Einzelzell-Arrays, zur parallelisierten Aufzeichnung von Einzelzell-Zeitverläufen der Expressionskinetik eines Fluoreszenzproteins. Die Proteinexpression wird dabei durch den Transport von synthetischer mRNA ins Zellinnere ausgelöst. Das Array wurde mit einem Perfusionssystem verbunden, um einen Flüssigkeitsaustausch während der Beobachtung am Mikroskop zu ermöglichen. Dadurch war erstmals die Aufnahme der gesamten Fluoreszenzprotein-Expressionskinetik einschließlich der Anfangsphase in Abhängigkeit eines definierten Zeitintervalls der mRNA Nanopartikelexposition messbar. Die Translationskinetik wurde dabei durch das Auslesen der Fluoreszenzintensitätszeitverläufe einzelner Zellen auf der Mikrostrukturierung erhalten. Um die Zeitverläufe der Translation zu quantifizieren, wurden in dieser Arbeit verschiedene biochemische Raten-Modelle auf der Grundlage gewöhnlicher Differentialgleichungen untersucht. Das Modell, das die experimentellen Daten am besten beschreibt, wurde genutzt, um die kinetischen Raten jeder einzelnen Zelle zu ermitteln. Die Einzelzellparameter ermöglichten dabei die Bestimmung der Populationsverteilung jedes Parameters und damit der Zell-zu-Zell Variabilität. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die präzise Messung von Einzelzellkinetiken genutzt, um den Expressionsbeginn jeder Zelle zu bestimmen. Dieser gibt Auskunft über die Dauer des mRNA Transportprozesses. Wir zeigten anhand von zwei Modellsystemen, Lipofectamine und Lipidnanopartikeln (LNP), dass die Dauer des mRNA Transports nicht mit der Effizienz des Transports in einzelnen Zellen korreliert. Wir konnten zeigen, dass sich diese Parameter in Abhängigkeit steigender Serumproteinkonzentration systematisch ändern. Die Serumproteinadsorption beeinflusst sowohl den Zeitpunkt als auch die Effizienz von Lipofectamine negativ, während sie im Gegensatz dazu den Zeitpunkt und die Effizienz der LNP-vermittelten Transfektion verbessert. Dies spielt für die medizinische Anwendung eine große Rolle da die Nanopartikel üblicherweise über das Blut verabreicht werden und dabei in Kontakt mit Serumproteinen kommen. Der entwickelte Assay stellt zusätzlich eine neue Chance zur Quantifizierung der mRNA Halbwertszeit in lebenden Zellen dar. Die mRNA Halbwertszeit ist ein Schlüsselparameter der Translationsregulation und unter Anderem abhängig von der poly(A) Schwanzlänge. Es ist jedoch nicht quantifiziert, wie genau die mRNA Halbwertszeit von der poly(A) Schwanzlänge abhängt. Zu diesem Zweck wurden mRNA Konstrukte mit zehn unterschiedlichen poly(A) Längen untersucht. Auf Grundlage der Messergebnisse formulierten wir erstmals ein einfaches Modell, das die Beziehung zwischen poly(A) Länge und mRNA Lebenszeit mittels eines Potenzgestezes mit einem Exponenten von 0,53 beschreibt. Nutzt man für den Einzelzell-Translationsassay die Aufnahme eines weiteren Fluoreszenzsignals sind zusätzliche intrazelluläre Korrelationsstudien möglichen. Dies kann beispielsweise eingesetzt werden um die mRNA-Nanopartikel detektierbar zu machen wodurch der zeitliche Abstand zwischen Nanopartikeladsorption an der Zelloberfläche und dem Proteinexpressionsbeginn messbar ist. Durch eine degradationsabhängige Fluoreszenzmarkierung der mRNA könnten zukünftig mit Hilfe der Einzelzellarrays die zeitlichen Veränderungen der mRNA- und Proteinkonzentration zur genaueren Auflösung der mRNA Degradation simultan gemessen werden.