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Die Rolle von LGR6 in der Genese des humanen duktalen Pankreaskarzinoms (PDAC)
Die Rolle von LGR6 in der Genese des humanen duktalen Pankreaskarzinoms (PDAC)
Das duktale Pankreaskarzinom zählt zu den Tumorerkrankungen mit der schlechtesten Prognose. Dies liegt zum einen an der späten Diagnose im fortgeschrittenen Stadium, sowie der frühen Metastasierung und nicht zuletzt an der Zytostatikaresistenzentwicklung. Vor allem die beiden letzteren Eigenschaften werden den Krebsstammzellen zugeschrieben. Neben zahlreichen bekannten Signalwegen wird auch dem Wnt- Signalweg eine wichtige Rolle im Entstehungsprozess von Tumorstammzellen zuteil. Ein regulatorisches Element in der Signalkette des Wnt-Mechanismus sind die zu den G-Protein-gekoppelten 7-Transmembranprotein Superfamilie gehörenden leucine-rich repeat containing G-protein-coupled-receptor (LGR) und ihren zugeordneten Liganden den R-Spondinen. Zusammen bilden sie einen Verstärkerkomplex des Wnt-Signalweges. Es wurde die Grundexpression von RSPO und LGR in vier verschiedenen humanen duktalen Pankreaskarzinomzelllinien untersucht. Diese wurden aufgrund ihres morphologischen Erscheinungsbildes und der Expression etablierter Stammzellmarker in mesenchymale Zelllinien, welche sich durch ein schnelles Wachstum sowie eine niedrige Differenzierung auszeichnen und in epitheliale Zelllinien, welche langsamer wachsen und höher differenziert sind, unterschieden. Zunächst wurde die Grundexpression von RSPO1 und RSPO4 mit Hilfe der real-time PCR auf Genebene untersucht. Zum Nachweis einer Proteinexpression wurde aufgrund der Charakterisierung der RSPOs als lösliche Liganden der ELISA-Essay verwendet. Interessant war, alle untersuchten Zelllinien zeigten eine etwa gleich hohe Konzentration von RSPO1 und RSPO4 auf. Die Genanalysen wiesen jedoch auf eine deutliche Diskrepanz hin. Die Expression von RSPO1 als auch von RSPO4 sind in den mesenchymalen Zelllinien deutlich höher. Dies führte zu der Hypothese, dass RSPOs sekretiert werden. Eine signifikante Konzentration der RSPOs im Zellkulturmedium war nicht möglich. Da an der Zelloberfläche gebundene RSPOs im Zelllysat mit erfasst werden, kann die Hypothese der aktiven Sekretion aktuell weder nachgewiesen noch wiederlegt werden und bleibt Gegenstand aktueller Forschungen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Untersuchung von LGR6, welches in verschiedenen Geweben (Haarfollikeln, Geschmackspapillen, Lunge und Brustdrüsengeweben) als Stammzellmarker beschrieben wurde. Mit Hilfe der real-time PCR gelang der Nachweis einer Genexpression in den untersuchten Zelllinien. Weiterführend wurde ausgehend von der Annahme, dass LGR6 ein Oberflächenrezeptor ist, die Durchflusszytometrie durchgeführt. Der Nachwies von LGR6 auf der Zelloberfläche gelang nicht, sodass Western Blots erfolgten, die eine LGR6-Expression auf Proteinebene aufzeigen konnten und darüber hinaus die Ergebnisse aus den Genanalysen bestätigten. Insgesamt war die LGR6-Expression in den epithelialen Pankreaszelllinien signifikant höher als in den mesenchymalen Zelllinien. Ein weiterer interessanter Aspekt der Untersuchung von LGR6 ist die Beschreibung drei bekannter Splicevarianten. Zur weiteren Untersuchung wurden Primer konzipiert, welche die Splicevarienten detektierten und Expressionsunterschiede zwischen diesen Varianten zeigten, so wird die kanonische Splicevariante in allen Zelllinien exprimiert, wohingegen zwei der drei Varianten nur in epithelialen Zellen exprimiert wurde. Auf dem Proteinlevel kamen eine kleinere und eine große Isoform zur Darstellung. Auch hier fielen deutliche Unterschiede in den Expressionen auf. Weiterführende Untersuchungen erfolgten mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbung (Immunhistochemie). Interessanterweise gelang es die kanonische Isoform im Golgi-Apparat mesenchymaler Zellen nachzuweisen. Dies überraschte, da die Expression in epithelialen Zellen deutlich höher war. Die Ergebnisse weisen auf unterschiedliche Funktionen der Varianten von LGR6 hin. Einen weiteren Versuchsaufbau stellte die exogene Stimulierung von humanen duktalen Pankreaskarzinomzelllinien mit RSPO2 dar, einem potenten Stimulator des Wnt-Signalweges. Aufgrund einer erhöhten Genexpression von LGR6 kann auf eine Rolle als mögliches Wnt-Zielgen geschlossen werden. Darüber hinaus wurden unter Behandlung mit dem etablierten Zytostatikum Gemcitabin die Veränderung der RSPO- und LGR6-Expression untersucht und beobachtet, dass die Genexpression von RSPO1 und RSPO4 deutlich erhöht sind. Unter Gemcitabin scheint die LGR6-Expression insgesamt abzunehmen. Zusammenfassend wurde erstmals die Expression von RSPO1 und RSPO4 sowie von LGR6 in humanen duktalen Pankreaskarzinomzelllinien nachgewiesen. Es gibt Hinweise auf bestehende Unterschiede in der Expression zwischen wenig differenzierten und höher differenzierten Tumorzellen. LGR6 konnte als mögliches neues Wnt-Zielgen identifiziert werden.
BxPC3, DanG, humanes duktales Pankreaskarzinom, LGR4, LGR6, MiaPaCa2, Panc1, PDAC, RSPO1, RSPO4
Härtwig, Daniel
2019
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Härtwig, Daniel (2019): Die Rolle von LGR6 in der Genese des humanen duktalen Pankreaskarzinoms (PDAC). Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Das duktale Pankreaskarzinom zählt zu den Tumorerkrankungen mit der schlechtesten Prognose. Dies liegt zum einen an der späten Diagnose im fortgeschrittenen Stadium, sowie der frühen Metastasierung und nicht zuletzt an der Zytostatikaresistenzentwicklung. Vor allem die beiden letzteren Eigenschaften werden den Krebsstammzellen zugeschrieben. Neben zahlreichen bekannten Signalwegen wird auch dem Wnt- Signalweg eine wichtige Rolle im Entstehungsprozess von Tumorstammzellen zuteil. Ein regulatorisches Element in der Signalkette des Wnt-Mechanismus sind die zu den G-Protein-gekoppelten 7-Transmembranprotein Superfamilie gehörenden leucine-rich repeat containing G-protein-coupled-receptor (LGR) und ihren zugeordneten Liganden den R-Spondinen. Zusammen bilden sie einen Verstärkerkomplex des Wnt-Signalweges. Es wurde die Grundexpression von RSPO und LGR in vier verschiedenen humanen duktalen Pankreaskarzinomzelllinien untersucht. Diese wurden aufgrund ihres morphologischen Erscheinungsbildes und der Expression etablierter Stammzellmarker in mesenchymale Zelllinien, welche sich durch ein schnelles Wachstum sowie eine niedrige Differenzierung auszeichnen und in epitheliale Zelllinien, welche langsamer wachsen und höher differenziert sind, unterschieden. Zunächst wurde die Grundexpression von RSPO1 und RSPO4 mit Hilfe der real-time PCR auf Genebene untersucht. Zum Nachweis einer Proteinexpression wurde aufgrund der Charakterisierung der RSPOs als lösliche Liganden der ELISA-Essay verwendet. Interessant war, alle untersuchten Zelllinien zeigten eine etwa gleich hohe Konzentration von RSPO1 und RSPO4 auf. Die Genanalysen wiesen jedoch auf eine deutliche Diskrepanz hin. Die Expression von RSPO1 als auch von RSPO4 sind in den mesenchymalen Zelllinien deutlich höher. Dies führte zu der Hypothese, dass RSPOs sekretiert werden. Eine signifikante Konzentration der RSPOs im Zellkulturmedium war nicht möglich. Da an der Zelloberfläche gebundene RSPOs im Zelllysat mit erfasst werden, kann die Hypothese der aktiven Sekretion aktuell weder nachgewiesen noch wiederlegt werden und bleibt Gegenstand aktueller Forschungen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Untersuchung von LGR6, welches in verschiedenen Geweben (Haarfollikeln, Geschmackspapillen, Lunge und Brustdrüsengeweben) als Stammzellmarker beschrieben wurde. Mit Hilfe der real-time PCR gelang der Nachweis einer Genexpression in den untersuchten Zelllinien. Weiterführend wurde ausgehend von der Annahme, dass LGR6 ein Oberflächenrezeptor ist, die Durchflusszytometrie durchgeführt. Der Nachwies von LGR6 auf der Zelloberfläche gelang nicht, sodass Western Blots erfolgten, die eine LGR6-Expression auf Proteinebene aufzeigen konnten und darüber hinaus die Ergebnisse aus den Genanalysen bestätigten. Insgesamt war die LGR6-Expression in den epithelialen Pankreaszelllinien signifikant höher als in den mesenchymalen Zelllinien. Ein weiterer interessanter Aspekt der Untersuchung von LGR6 ist die Beschreibung drei bekannter Splicevarianten. Zur weiteren Untersuchung wurden Primer konzipiert, welche die Splicevarienten detektierten und Expressionsunterschiede zwischen diesen Varianten zeigten, so wird die kanonische Splicevariante in allen Zelllinien exprimiert, wohingegen zwei der drei Varianten nur in epithelialen Zellen exprimiert wurde. Auf dem Proteinlevel kamen eine kleinere und eine große Isoform zur Darstellung. Auch hier fielen deutliche Unterschiede in den Expressionen auf. Weiterführende Untersuchungen erfolgten mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbung (Immunhistochemie). Interessanterweise gelang es die kanonische Isoform im Golgi-Apparat mesenchymaler Zellen nachzuweisen. Dies überraschte, da die Expression in epithelialen Zellen deutlich höher war. Die Ergebnisse weisen auf unterschiedliche Funktionen der Varianten von LGR6 hin. Einen weiteren Versuchsaufbau stellte die exogene Stimulierung von humanen duktalen Pankreaskarzinomzelllinien mit RSPO2 dar, einem potenten Stimulator des Wnt-Signalweges. Aufgrund einer erhöhten Genexpression von LGR6 kann auf eine Rolle als mögliches Wnt-Zielgen geschlossen werden. Darüber hinaus wurden unter Behandlung mit dem etablierten Zytostatikum Gemcitabin die Veränderung der RSPO- und LGR6-Expression untersucht und beobachtet, dass die Genexpression von RSPO1 und RSPO4 deutlich erhöht sind. Unter Gemcitabin scheint die LGR6-Expression insgesamt abzunehmen. Zusammenfassend wurde erstmals die Expression von RSPO1 und RSPO4 sowie von LGR6 in humanen duktalen Pankreaskarzinomzelllinien nachgewiesen. Es gibt Hinweise auf bestehende Unterschiede in der Expression zwischen wenig differenzierten und höher differenzierten Tumorzellen. LGR6 konnte als mögliches neues Wnt-Zielgen identifiziert werden.