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Novel strategies for targeted therapy in NETs. inhibition of Wnt signaling in neuroendocrine tumors and improving peptide receptor chemoradionuclide therapy (PRCRT) by a combination of 5-fluorouracil and epigenetic modifiers
Novel strategies for targeted therapy in NETs. inhibition of Wnt signaling in neuroendocrine tumors and improving peptide receptor chemoradionuclide therapy (PRCRT) by a combination of 5-fluorouracil and epigenetic modifiers
Neuroendokrine Tumoren (NET) sind seltene Tumoren mit häufiger Primaruslokalisation im GastroEnteroPankreatischen System und in der Lunge. Die Behandlungsstrategie der NET hängt von der Tumorlokalisation, dem Grading, dem Staging und der hormonellen Funktionalität ab. Durch eine Operation können NET bei frühen lokalisierten Erkrankungsstadien kurativ behandelt werden. Die palliative Therapie von fortgeschrittenen inoperablen NETs umfasst verschiedenen Systemtherapieansätze wie Biotherapie mit Somatostatin-Analoga und Interferon-alpha, Peptid Rezeptor Radionuklid Therapie (PRRT), Chemotherapie oder molekular zielgerichtete Therapieoptionen. In den letzten Jahren wurden signifikante Verbesserungen bezüglich der Tumorkontrolle in der Systemtherapie von NET erreicht, jedoch besteht weiterhin ein Bedarf die molekularbiologischen Mechanismen der Tumorzelle vertieft zu verstehen und neuartige Behandlungsstrategien für eine weiter verbesserte Systemtherapie von NET zu entwickeln. Vor diesem Hintergrund wurden im Rahmen der hier vorgelegten Dissertationsarbeit zwei neue Strategien der “targeted therapy” in humanen NET Zelllinien in vitro untersucht: Kapitel 1: Hintergrund und Zielsetzung: Der Wnt/β-Catenin Signalweg spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen Malignomen. Strategien zur “targeted therapy” des Wnt/β-Catenin Signalwegs sind aktuell in klinischer Entwicklung. Bei NET ist die Rolle des Wnt/β-Catenin Signalweg bisher nur unvollständig untersucht - so reguliert beispielsweise das Tumorsuppressorprotein Menin (Gen MEN1) in NET Zellen den Abbau von Beta-Catenin. Die hier vorgelegte Studie untersuchte die Effekte des Porcupine (PORCN) Inhibitors WNT974, des direkten β-Catenin-Inhibitors PRI724 und von β-Catenin small interfering (si)RNAs in den humanen neuroendokrinen Tumor (NET) -Zelllinien BON1, QGP und H727 in vitro. Methoden: Die NET-Zellen wurden mit WNT974 oder PRI724 inkubiert oder mit β-Catenin siRNAs transient transfiziert und anschliessend jeweils Zellproliferationsassays, Durchflusszytometrie, Caspase3/7-Test und verschiedene Western-Blot-Analysen durchgeführt.. Ergebnisse: Die Behandlung von NET-Zellen mit dem PORCN-Inhibitor WNT974 inhibierte die Zellvitalität auf dosis- und zeitabhängige Weise signifikant. Analog führte auch die Inkubation verschiedener NET-Zelllinien mit dem β-Catenin-Inhibitor PRI724 zu einer signifikanten Wachstumshemmung. Der siRNA-vermittelte Knockdown der β-Catenin-Expression reduzierte die Vitalität der BON1-Tumorzellen, jedoch nicht der H727-Tumorzellen. In den untersuchten NET Zelllinien inhibierte der PORCN Inhibitor WNT974 in Westernblot-Analysen nicht nur das “canonical Wnt signaling” (zum Beispiel: LRP6 Rezeptor, β-Catenin und downstream targets wie c-Myc und cyclinD1) sondern auch das “non-canonical Wnt signaling” (zum Beispiel pAKT/mTOR-, pEGFR- und pIGFR-Signaling). Zusammenfassung und Schlussfolgerung: Der Porcupine (PORCN) Inhibitor WNT974 oder der direkte β-Catenin-Inhibitor PRI724 führten in NET Zellinien in vitro zu einer spezifischen Hemmung des Wnt/β-Catenin Signalwegs und signifikanten antiproliferativen Effekten. Weitere präklinische und klinische Studien zur Untersuchung der möglichen Rolle einer Inhibition des Wnt/β-Catenin Signalwegs als “targeted therapy” bei NET sollten angestrebt werden. Kapitel 2: Hintergrund und Zielsetzung: Zur weiteren Effektivitätssteigerung der Peptid Rezeptor Radionuklid Therapie (PRRT) in der Therapie von NET wird aktuell die sogenannte Peptid Rezeptor Chemo Radio Therapie (PRCRT) in präklinischen und klinischen Studien evaluiert. Die hier vorgelegte Studie untersuchte die Effekte von 5-Fluorouracil (5-FU) jeweils in Kombination mit dem DNA Methyltransferase Inhibitor Decitabin (DEC) und dem Histon Deacetylase Inhibitor Tacedinalin (TAC) in humanen neuroendokrinen Tumor (NET) -Zelllinien BON1, QGP und H727 in vitro. Methoden: Die humanen NET-Zelllinien BON1 und QGP1 wurden mit 5-FU alleine oder in Kombination mit DEC oder TAC behandelt. Die Radiosensitivität der Tumorzellen wurde nach Inkubation mit den jeweiligen Testsubstanzen mit Gamma-Bestrahlung (γ-IR) in Dosierungen von 0, 2, 4 oder 6 Gy getestet. Die Somatostatinrezeptor Typ 2 (SSTR2) -Expression und die [68Ga] Ga-DOTA-TOC-Radioligandenbindung der NET-Zelllinien wurde untersucht. Zellproliferationsassay, Colony-Formation-Assay, Western-Blot-Analyse und Radioligandenbindungsassay wurden hierzu angewandt. Ergebnisse: Die Behandlung mit 5-FU plus DEC oder TAC hemmte die Vitalität der Tumorzellen im Zellproliferationsassay und regulierte die Expression von Zellzyklusmarkern sowie von pro- und antiapoptotischen Proteinen – so wurden zum Beispiel aktivierte Caspase-3, cleaved-PARP und p21 induziert, während Bcl-2, CHK1, CyclinD1, CDK1 inhibiert wurden. 5-FU allein oder in Kombination mit DEC oder TAC steigerte jeweils die Radiosensitivität der Tumorzellen signifikant, wobei in BON1 Zellen Sensibilisierungsverstärkungsverhältnisse (SER) von 2,19, 3,96 und 9,46 und in QGP1 Zellen Sensibilisierungsverstärkungsverhältnisse (SER) von 1,20, 1,31 bzw. 1,87 bestimmt wurden. Die Behandlung mit 5-FU allein oder plus DEC oder TAC induzierte signifikant die Somatostatinrezeptor-Typ-2-Expression (SSTR2) der Tumorzellen und verursachte in vitro eine stärkere Bindung des Radioliganden 68Ga-DOTATOC an die Tumorzellen. Zusammenfassung und Schlussfolgerung: Die Kombination von 5-FU mit epigenetischen Modifiern wie DNMT Inhibitoren oder HDAC Inhibitoren zeigte am Model von humanen NET Tumorzellen in vitro: i) antiproliferative Effekte, ii) Radiosensibilisierung iii) Steigerung der Expression der Somatostatin Rezeptor Typ 2 (SSTR2) Expression, iv) Steigerung der Radioligandenbindung von 68Ga-DOTATOC. Diese präklinischen in vitro Ergebnisse legen nahe, dass eine PRCRT mit 5-FU in Kombination mit epigenetischen Modifiern wie DNMT Inhibitoren oder HDAC Inhibitoren eine vielversprechende mögliche Strategie zur weiteren Verbesserung der Wirksamkeit der PRRT bei der Behandlung von NETs sein könnte. Weitere präklinische und klinische Studien sollten angestrebt werden.
Not available
Jin, Xifeng
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Jin, Xifeng (2019): Novel strategies for targeted therapy in NETs: inhibition of Wnt signaling in neuroendocrine tumors and improving peptide receptor chemoradionuclide therapy (PRCRT) by a combination of 5-fluorouracil and epigenetic modifiers. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Neuroendokrine Tumoren (NET) sind seltene Tumoren mit häufiger Primaruslokalisation im GastroEnteroPankreatischen System und in der Lunge. Die Behandlungsstrategie der NET hängt von der Tumorlokalisation, dem Grading, dem Staging und der hormonellen Funktionalität ab. Durch eine Operation können NET bei frühen lokalisierten Erkrankungsstadien kurativ behandelt werden. Die palliative Therapie von fortgeschrittenen inoperablen NETs umfasst verschiedenen Systemtherapieansätze wie Biotherapie mit Somatostatin-Analoga und Interferon-alpha, Peptid Rezeptor Radionuklid Therapie (PRRT), Chemotherapie oder molekular zielgerichtete Therapieoptionen. In den letzten Jahren wurden signifikante Verbesserungen bezüglich der Tumorkontrolle in der Systemtherapie von NET erreicht, jedoch besteht weiterhin ein Bedarf die molekularbiologischen Mechanismen der Tumorzelle vertieft zu verstehen und neuartige Behandlungsstrategien für eine weiter verbesserte Systemtherapie von NET zu entwickeln. Vor diesem Hintergrund wurden im Rahmen der hier vorgelegten Dissertationsarbeit zwei neue Strategien der “targeted therapy” in humanen NET Zelllinien in vitro untersucht: Kapitel 1: Hintergrund und Zielsetzung: Der Wnt/β-Catenin Signalweg spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen Malignomen. Strategien zur “targeted therapy” des Wnt/β-Catenin Signalwegs sind aktuell in klinischer Entwicklung. Bei NET ist die Rolle des Wnt/β-Catenin Signalweg bisher nur unvollständig untersucht - so reguliert beispielsweise das Tumorsuppressorprotein Menin (Gen MEN1) in NET Zellen den Abbau von Beta-Catenin. Die hier vorgelegte Studie untersuchte die Effekte des Porcupine (PORCN) Inhibitors WNT974, des direkten β-Catenin-Inhibitors PRI724 und von β-Catenin small interfering (si)RNAs in den humanen neuroendokrinen Tumor (NET) -Zelllinien BON1, QGP und H727 in vitro. Methoden: Die NET-Zellen wurden mit WNT974 oder PRI724 inkubiert oder mit β-Catenin siRNAs transient transfiziert und anschliessend jeweils Zellproliferationsassays, Durchflusszytometrie, Caspase3/7-Test und verschiedene Western-Blot-Analysen durchgeführt.. Ergebnisse: Die Behandlung von NET-Zellen mit dem PORCN-Inhibitor WNT974 inhibierte die Zellvitalität auf dosis- und zeitabhängige Weise signifikant. Analog führte auch die Inkubation verschiedener NET-Zelllinien mit dem β-Catenin-Inhibitor PRI724 zu einer signifikanten Wachstumshemmung. Der siRNA-vermittelte Knockdown der β-Catenin-Expression reduzierte die Vitalität der BON1-Tumorzellen, jedoch nicht der H727-Tumorzellen. In den untersuchten NET Zelllinien inhibierte der PORCN Inhibitor WNT974 in Westernblot-Analysen nicht nur das “canonical Wnt signaling” (zum Beispiel: LRP6 Rezeptor, β-Catenin und downstream targets wie c-Myc und cyclinD1) sondern auch das “non-canonical Wnt signaling” (zum Beispiel pAKT/mTOR-, pEGFR- und pIGFR-Signaling). Zusammenfassung und Schlussfolgerung: Der Porcupine (PORCN) Inhibitor WNT974 oder der direkte β-Catenin-Inhibitor PRI724 führten in NET Zellinien in vitro zu einer spezifischen Hemmung des Wnt/β-Catenin Signalwegs und signifikanten antiproliferativen Effekten. Weitere präklinische und klinische Studien zur Untersuchung der möglichen Rolle einer Inhibition des Wnt/β-Catenin Signalwegs als “targeted therapy” bei NET sollten angestrebt werden. Kapitel 2: Hintergrund und Zielsetzung: Zur weiteren Effektivitätssteigerung der Peptid Rezeptor Radionuklid Therapie (PRRT) in der Therapie von NET wird aktuell die sogenannte Peptid Rezeptor Chemo Radio Therapie (PRCRT) in präklinischen und klinischen Studien evaluiert. Die hier vorgelegte Studie untersuchte die Effekte von 5-Fluorouracil (5-FU) jeweils in Kombination mit dem DNA Methyltransferase Inhibitor Decitabin (DEC) und dem Histon Deacetylase Inhibitor Tacedinalin (TAC) in humanen neuroendokrinen Tumor (NET) -Zelllinien BON1, QGP und H727 in vitro. Methoden: Die humanen NET-Zelllinien BON1 und QGP1 wurden mit 5-FU alleine oder in Kombination mit DEC oder TAC behandelt. Die Radiosensitivität der Tumorzellen wurde nach Inkubation mit den jeweiligen Testsubstanzen mit Gamma-Bestrahlung (γ-IR) in Dosierungen von 0, 2, 4 oder 6 Gy getestet. Die Somatostatinrezeptor Typ 2 (SSTR2) -Expression und die [68Ga] Ga-DOTA-TOC-Radioligandenbindung der NET-Zelllinien wurde untersucht. Zellproliferationsassay, Colony-Formation-Assay, Western-Blot-Analyse und Radioligandenbindungsassay wurden hierzu angewandt. Ergebnisse: Die Behandlung mit 5-FU plus DEC oder TAC hemmte die Vitalität der Tumorzellen im Zellproliferationsassay und regulierte die Expression von Zellzyklusmarkern sowie von pro- und antiapoptotischen Proteinen – so wurden zum Beispiel aktivierte Caspase-3, cleaved-PARP und p21 induziert, während Bcl-2, CHK1, CyclinD1, CDK1 inhibiert wurden. 5-FU allein oder in Kombination mit DEC oder TAC steigerte jeweils die Radiosensitivität der Tumorzellen signifikant, wobei in BON1 Zellen Sensibilisierungsverstärkungsverhältnisse (SER) von 2,19, 3,96 und 9,46 und in QGP1 Zellen Sensibilisierungsverstärkungsverhältnisse (SER) von 1,20, 1,31 bzw. 1,87 bestimmt wurden. Die Behandlung mit 5-FU allein oder plus DEC oder TAC induzierte signifikant die Somatostatinrezeptor-Typ-2-Expression (SSTR2) der Tumorzellen und verursachte in vitro eine stärkere Bindung des Radioliganden 68Ga-DOTATOC an die Tumorzellen. Zusammenfassung und Schlussfolgerung: Die Kombination von 5-FU mit epigenetischen Modifiern wie DNMT Inhibitoren oder HDAC Inhibitoren zeigte am Model von humanen NET Tumorzellen in vitro: i) antiproliferative Effekte, ii) Radiosensibilisierung iii) Steigerung der Expression der Somatostatin Rezeptor Typ 2 (SSTR2) Expression, iv) Steigerung der Radioligandenbindung von 68Ga-DOTATOC. Diese präklinischen in vitro Ergebnisse legen nahe, dass eine PRCRT mit 5-FU in Kombination mit epigenetischen Modifiern wie DNMT Inhibitoren oder HDAC Inhibitoren eine vielversprechende mögliche Strategie zur weiteren Verbesserung der Wirksamkeit der PRRT bei der Behandlung von NETs sein könnte. Weitere präklinische und klinische Studien sollten angestrebt werden.