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The regulation of XYLT1, the enzyme initiating glycosaminoglycan synthesis. an in vitro study with human immortalized fibroblasts with integrated reporter plasmid
The regulation of XYLT1, the enzyme initiating glycosaminoglycan synthesis. an in vitro study with human immortalized fibroblasts with integrated reporter plasmid
Several studies suggest that sodium is not only linked to extracellular fluids, but is also found in considerable amounts in other sites of the body including skin, muscle and arteries, where it is stored osmotically inactive, presumably bound to glycosaminoglycans. In a recent study, a correlation between tissue sodium concentrations, glycosaminoglycan content and the expression of XYLT1, the enzyme initiating glycosaminoglycan synthesis, was found. Thus, the aim of the present in vitro study was to investigate the potential regulation of XYLT1 expression in human fibroblast cells, in order to gain further insight into potential regulatory mechanisms of tissue sodium storage. We hypothesized that XYLT1 expression can be actively induced by external stimuli. As a tool for internal control of successful stimulation, human immortalized dermal fibroblasts were stably transfected with pathway specific reporter plasmids (TGF-beta/SMAD and NFAT5, respectively), with a fluorescent protein read-out (Gaussia Luciferase), allowing the monitoring of pathway activation status in response to different experimental conditions. XYLT1 expression was quantified by real-time PCR. We observed significant induction of XYLT1 expression by treatment with TGF-beta1 and TGF-beta3. Media with hypertonic sodium, elevated Vasopressin, Endothelin-1 and FGF23 concentrations, respectively, did not have significant effects on XYLT1 expression. In conclusion, we established functioning systems to monitor pathway activation status as internal control of treatment with TGF-beta and hypertonic sodium. Our data support the hypothesis that XYLT1 is actively regulated by TGF-beta, which strengthens the theory that there is active regulation of water-free sodium storage. To investigate this theory further, we suggest in vitro quantification of sodium concentration and glycosaminoglycan content relative to XYLT1 expression as a next step., Etliche Studien weisen darauf hin, dass Natrium im Körper nicht nur an extrazelluläre Flüssigkeit gebunden ist, sondern auch in bedeutenden Mengen in anderen Bereichen des Körpers, wie Haut, Muskeln und Arterien, existiert, wo es - vermutlich an Glykosaminoglykane gebunden - osmotisch inaktiv gespeichert wird. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde eine positive Korrelation zwischen Natriumkonzentrationen in Gewebe, Glykosaminoglykan-Gehalt und der Expression von XYLT1, dem Schlüsselenzym der Glykosaminoglykan-Synthese, gefunden. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb, die Regulation von XYLT1 näher zu untersuchen, um bessere Einsicht in die regulatorischen Mechanismen von Gewebe-Natriumspeichern zu erlangen. Unsere Hypothese war, dass XYLT1-Expression durch externe Stimuli wie TGF-beta aktiv induziert werden kann. Für die Stimulationsexperimente wurde folgendes in vitro Zeltkulturmodell etabliert: Humane dermale Fibroblasten wurden stabil mit TGF-beta/SMAD oder NFAT5 Reportertransgenen transfiziert, um mittels eines fluoreszenten Reporterproteins den Aktivitätsstatus des jeweiligen Signalwegs unter verschiedenen experimentellen Bedingungen verfolgen zu können. Dies ermöglichte eine interne Kontrolle für erfolgreiche Stimulation. Nach Inkubation mit unterschiedlichen Stimuli wurde XYLT1 Expression mittels quantitativer Echtzeit-PCR bestimmt. Als Ergebnis zeigte sich eine starke Induktion der XYLT1 Expression nach Stimulation mit TGF- beta1 und TGF-beta3. Inkubation mit erhöhten Konzentrationen von Natrium, Vasopressin, Endothelin-1 oder FGF23 hatte dagegen keinen Effekt auf XYLT1 Expression, im Vergleich zur Kontrolle. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein funktionierendes System zur Überwachung des Aktivitätsstatus von Signalwegen etabliert, das hier als Kontrolle für Stimulation mit TGF-beta und hypertonem Natrium diente. Die Ergebnisse der Stimulationsexperimente unterstützen die Hypothese, dass XYLT1 aktiv durch TGF-beta reguliert wird. Dies stärkt die Theorie, dass eine aktive Regulation der osmotisch inaktiven Gewebe-Natriumspeicher existiert. Um diese Theorie zu belegen, erscheint die Quantifizierung von Gewebe-Natriumkonzentration und Glykosaminoglykan-Gehalt in vitro relativ zu XYLT1 Expression ein wichtiger nächster Schritt.
XYLT1, glycosaminoglycans, water-free sodium storage, TGF-beta
Morhard, Marlena Christina
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Morhard, Marlena Christina (2019): The regulation of XYLT1, the enzyme initiating glycosaminoglycan synthesis: an in vitro study with human immortalized fibroblasts with integrated reporter plasmid. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Morhard_Marlena.pdf

2MB

Abstract

Several studies suggest that sodium is not only linked to extracellular fluids, but is also found in considerable amounts in other sites of the body including skin, muscle and arteries, where it is stored osmotically inactive, presumably bound to glycosaminoglycans. In a recent study, a correlation between tissue sodium concentrations, glycosaminoglycan content and the expression of XYLT1, the enzyme initiating glycosaminoglycan synthesis, was found. Thus, the aim of the present in vitro study was to investigate the potential regulation of XYLT1 expression in human fibroblast cells, in order to gain further insight into potential regulatory mechanisms of tissue sodium storage. We hypothesized that XYLT1 expression can be actively induced by external stimuli. As a tool for internal control of successful stimulation, human immortalized dermal fibroblasts were stably transfected with pathway specific reporter plasmids (TGF-beta/SMAD and NFAT5, respectively), with a fluorescent protein read-out (Gaussia Luciferase), allowing the monitoring of pathway activation status in response to different experimental conditions. XYLT1 expression was quantified by real-time PCR. We observed significant induction of XYLT1 expression by treatment with TGF-beta1 and TGF-beta3. Media with hypertonic sodium, elevated Vasopressin, Endothelin-1 and FGF23 concentrations, respectively, did not have significant effects on XYLT1 expression. In conclusion, we established functioning systems to monitor pathway activation status as internal control of treatment with TGF-beta and hypertonic sodium. Our data support the hypothesis that XYLT1 is actively regulated by TGF-beta, which strengthens the theory that there is active regulation of water-free sodium storage. To investigate this theory further, we suggest in vitro quantification of sodium concentration and glycosaminoglycan content relative to XYLT1 expression as a next step.

Abstract

Etliche Studien weisen darauf hin, dass Natrium im Körper nicht nur an extrazelluläre Flüssigkeit gebunden ist, sondern auch in bedeutenden Mengen in anderen Bereichen des Körpers, wie Haut, Muskeln und Arterien, existiert, wo es - vermutlich an Glykosaminoglykane gebunden - osmotisch inaktiv gespeichert wird. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde eine positive Korrelation zwischen Natriumkonzentrationen in Gewebe, Glykosaminoglykan-Gehalt und der Expression von XYLT1, dem Schlüsselenzym der Glykosaminoglykan-Synthese, gefunden. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb, die Regulation von XYLT1 näher zu untersuchen, um bessere Einsicht in die regulatorischen Mechanismen von Gewebe-Natriumspeichern zu erlangen. Unsere Hypothese war, dass XYLT1-Expression durch externe Stimuli wie TGF-beta aktiv induziert werden kann. Für die Stimulationsexperimente wurde folgendes in vitro Zeltkulturmodell etabliert: Humane dermale Fibroblasten wurden stabil mit TGF-beta/SMAD oder NFAT5 Reportertransgenen transfiziert, um mittels eines fluoreszenten Reporterproteins den Aktivitätsstatus des jeweiligen Signalwegs unter verschiedenen experimentellen Bedingungen verfolgen zu können. Dies ermöglichte eine interne Kontrolle für erfolgreiche Stimulation. Nach Inkubation mit unterschiedlichen Stimuli wurde XYLT1 Expression mittels quantitativer Echtzeit-PCR bestimmt. Als Ergebnis zeigte sich eine starke Induktion der XYLT1 Expression nach Stimulation mit TGF- beta1 und TGF-beta3. Inkubation mit erhöhten Konzentrationen von Natrium, Vasopressin, Endothelin-1 oder FGF23 hatte dagegen keinen Effekt auf XYLT1 Expression, im Vergleich zur Kontrolle. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein funktionierendes System zur Überwachung des Aktivitätsstatus von Signalwegen etabliert, das hier als Kontrolle für Stimulation mit TGF-beta und hypertonem Natrium diente. Die Ergebnisse der Stimulationsexperimente unterstützen die Hypothese, dass XYLT1 aktiv durch TGF-beta reguliert wird. Dies stärkt die Theorie, dass eine aktive Regulation der osmotisch inaktiven Gewebe-Natriumspeicher existiert. Um diese Theorie zu belegen, erscheint die Quantifizierung von Gewebe-Natriumkonzentration und Glykosaminoglykan-Gehalt in vitro relativ zu XYLT1 Expression ein wichtiger nächster Schritt.