In vivo reconstitution of heterochromatin

Sommer, Sebastian (2019): In vivo reconstitution of heterochromatin. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Unser Körper besteht aus ca. 200 verschieden Zellen, jede Zelle für sich ist hochspezialisiert. Die menschlichen Organe setzen sich aus riesigen Zellverbänden zusammen. Trotz dieser unglaublichen Vielfalt im menschlichen Köper besitzen alle Zellen das gleiche Genom. Diese Zelldifferenzierung wird letztendlich durch differentielle Genregulation erreicht. Chromatin ist nicht nur für eine kompakte Verpackung der DNA verantwortlich, sondern spielt auch eine maßgebende Rolle in der Genregulation. Bereits in den 1930 er Jahren des vergangenen Jahr- hunderts wurde zwischen zwei Chromatinarten bei Interphase Zellkernen unterschieden, He- terochromatin als eine stark kondensierte Chromatinstruktur mit vorwiegend reprimierten Genen und Euchromatin als eher lose und zugängliche Chromatinstruktur mit aktiv transkri- bierten Genen. Obwohl in den letzten 30 Jahren viele Proteine, die für das Heterochromatin verantwortlich sind, identifiziert worden sind, ist es immer noch unklar, welches Minimum an Faktoren ausreichend ist. Die Methlyierung von Histon H3 am Lysin 9 (H3K9me) und das Binden vom Heterochromatin Protein 1a (HP1a) an diese Histonmodifikation sind zwei wie- derkehrende Merkmale von Heterochromatin, und sind evolutiv von der Spalthefe (S. pombe) bis zum Menschen konserviert. In dieser Arbeit wollten wir nun mit Hilfe eines synthetisch-biologischen Ansatzes untersu- chen, ob diese beiden Faktoren, ausreichen um heterochromatische Chromatinstrukturen zu etablieren. Hierzu haben wir die H3K9 Methyltransferase dSu(var)3-9 und HP1a der Tauflie- ge (Drosophila melanogaster) in die Bäckerhefe (S. cerevisiae) eingebracht, die diese beiden Faktoren natürlicherweise nicht und nur rudimentäres Heterochromatin besitzt. Zum einen brachten wir dSu(var)3-9 mittels einer entsprechenden DNA-Bindungsdomäne gezielt an die gut untersuchten PHO Gene. Zum anderen untersuchten wir die genomweiten Veränderungen durch HP1a und/oder dSu(var)3-9. Methodisch untersuchten wir die Effekte mittels Massenspektrometrie, Chromatinimmunopräzipitation, DNaseI-indirekter Endmarkie- rung, Aktivitätsassays und Genexpressionsanalysen. Nach unserem besten Wissen konnten wir zum ersten Mal diese Histonmodifizierung neu in S. cerevisae einführen. Zu unserer Verwunderung hatte dies keinen Einfluss auf die Lebens- fähigkeit von S. cerevisiae. Das Fusionkonstrukt mit einer Pho4-DNA-Bindungsdomäne konnte die Expression der PHO Gene reduzieren, wahrscheinlich mittels Rekrutierung der Histondeacetylase (HDAC) Rpd3. Die Genrepression war unabhängig von der H3K9 Methyl- ierung. Eine Koexpression von HP1a zeigte einen Synergismus und veränderte die Chroma- tinstruktur des PHO5 Promoters. HP1a allein reprimierte überraschenderweise bereits die PHO und HIS3 Gene. In allen Expe- rimenten erwies sich die chromoshadow Domäne von HP1a als essentiell für dessen Funktion. Unsere genomweiten Expressionsanalysen zeigten, dass weder HP1a noch dSu(var)3-9 gene- relle Repressoren sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich mit Hilfe der synthetischen Biologie hetero- chromatische Mechanismen in einem „neutralen Hintergund“ gut untersuchen lassen. So konnten wir zeigen, dass H3K9me für sich nahezu keinen Effekt auf die Genexpression oder auf die Ausbildung von Heterochromatin hatte. Stattdessen identifizierten wir eine hochkon- servierte Funktion einer HDAC-Rekrutierung durch eine Methyltransferase und zeigten, dass HP1a-Effekte von der chromoshadow Domäne abhängen und unabhängig von einer Bindung an H3K9me sein können.

Abstract

Our body consists of about 200 different cell types, each one of them specialized in its own way. Groups of cells form similarly specialized organs. Despite this heterogeneity of cells in our body, all cells contain largely the same DNA, and cell diversity is achieved through the differential regulation of gene expression in each cell. Chromatin plays an important role, not just in DNA packaging, but also in gene regulation. In the 1930s scientists already distin- guished two types of chromatin in the interphase nuclei of many eukaryotic cells: a highly condensed form, called heterochromatin, and a less condensed form, called euchromatin. Euchromatin is associated with transcriptionally active genes, whereas heterochromatin con- tains mainly repressed genes. Although many factors are already identified responsible for this highly condensed chromatin, it is still unclear which factors are sufficient for gene repres- sion. Methylation of histone H3 at lysine 9 (H3K9) and binding of Heterochromatin Protein 1a (HP1a) at this modification mark are strongly associated with heterochromatin and well con- served from the unicellular fission yeast S. pombe to humans. Using a synthetic biology approach, we asked to what extent heterochromatin features can be reconstituted with just the combination of methylated H3K9 and HP1. We tested the reconsti- tution of heterochromatin in vivo by expressing the Drosophila melanogaster H3K9 methyl- transferase dSu(var)3-9 and HP1a into the budding yeast S. cerevisiae, which serves as an in this regard neutral cellular background as this yeast lacks H3K9me and HP1 and posseses only rudimentary heterochromatin. We followed two approaches. First, we targeted the methyltransferase via sequence specific DNA-binding domains to the well-studied PHO genes and analysed chromatin changes at these loci. Second, we looked at genome-wide expression changes after introduction of HP1a and / or the methyltransferase. As readout we employed a wide variety of methods, i.e., mass spectrometry, chromatin immunoprecipitation (ChIP), DNAseI indirect-endlabeling, gene product activity assays, and microarray transcriptome analysis. To our knowledge, we were the first to successfully introduce H3K9me as a novel histone modification in budding yeast. To our surprise, S. cerevisiae viability and global gene expres- sion was not much affected. Nonetheless, targeting of dSu(var)3-9 to the PHO genes re- pressed these. The repressive effect was independent of H3K9 methylation and probably me- diated by a highly conserved direct interaction between dSu(var)3-9 and the histone deacety- lase (HDAC) Rpd3. Coexpression with HP1a led to synergistic repression at the PHO genes and an altered chromatin structure, again independent of H3K9 methylation. Very surprisingly, non-targeted HP1a alone already led to significant reduction of gene ex- pression at the PHO and HIS3 genes. Throughout our studies the HP1a chromoshadow do- main was essential for the repressive effects and for interacting with dSu(var)3-9. Transcriptome analyses revealed that HP1a and / or dSu(var)3-9 were not global transcrip- tional repressors. In summary, our synthetic biology approach is feasible to study heterochromatin mechanisms in a “neutral background” system. This way, we found that the methylation of H3K9 as such had hardly any effect on gene expression or heterochromatin formation. Instead, we identified a highly conserved role of this methyltransferase in recruiting a histone deacetylase and found HP1a effects that were dependent on its chromoshadow domain but independent on binding methylated H3K9.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 2. Mai 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Korber, Philipp