Biomarkers of arachidonic acid metabolism as predictors for presence of cardiovascular disease

Kleinhempel, Alisa (2019): Biomarkers of arachidonic acid metabolism as predictors for presence of cardiovascular disease. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Eicosanoids are important lipid mediators primarily generated from arachidonic acid (AA) which is liberated out of membrane phospholipids by phospholipase A2 (PLA2). AA is metabolized by cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX) pathways to a number of different metabolites such as thromboxanes, prostaglandins, hydroxyeicosatetraenoic acids (HETE) or leukotrienes. Several lines of evidence implicate an important role of eicosanoids in central processes of inflammation and due to their widespread synthesis in blood and vascular cells these metabolites may play a central role in atherogenesis. On account of this, the analysis of the AA metabolism in whole blood might provide a new marker of atherosclerotic burden and is predestinated as biomarker for diagnosis and prediction of coronary artery disease (CAD). In previous work, we developed an in vitro assay where whole blood from patients was stimulated with 1 µg/mL lipopolysaccharide (LPS) for 24 hours. Samples were centrifuged and AA metabolites such as AA, 5-HETE, 11-HETE, 12-HETE, prostaglandin F2α (PGF2α), prostaglandin E2 (PGE2) and thromboxane B2 (TxB2) were analyzed out of supernatant by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Furthermore, messenger ribonucleic acid for quantitative gene expression analysis of COX-2 and prostaglandin E synthase (PGES) was isolated out of cellular components. In the current thesis, we improved the in vitro whole blood activation model and established additional quantitative real time polymerase chain reaction assays for PLA2, COX-1, thromboxane synthase (TXAS), prostaglandin F synthase (PGFS), 5-LOX, 5-LOX activating protein (FLAP) and 12-LOX gene expression analysis to cover major routes of AA metabolism and investigate the discriminatory potential of these eicosanoid pathways for inflammatory diseases. Furthermore, different stimuli (LPS, tumor necrosis factor alpha and oxidized low-density-lipoprotein) for whole blood activation have been evaluated. Our data revealed most significant effects for LPS which were time- but not dose-dependent. Since we observed a rapid eicosanoid response upon stimulation we asked whether eicosanoid response on gene expression and metabolite level is preformed or underlies de novo synthesis. To this end, transcriptional and translational inhibition experiments were performed to characterize these regulatory mechanisms. Data suggested that the production of metabolites underlies de novo synthesis upon stimulation, which is controlled both, at the level of transcription and translation. We then applied the new in vitro whole blood assay to test the variability of the LPS-induced AA metabolism in healthy subjects. We showed major inter-individual differences for all investigated target genes as well as metabolites, suggesting that varying eicosanoid response might be predisposing towards different susceptibility to inflammatory diseases. The predictive potential of the individual eicosanoid response for the presence of atherosclerosis was examined in 92 patients with or without CAD using the newly developed whole-blood assay. We found that the eicosanoid response on gene expression (COX-1, COX-2, PGES and FLAP) and metabolite level (AA, 5-, 11- and 12-HETE) was significantly (P<0.05) different in patients with or without CAD. These data allowed developing a score consisting of three biomarkers of AA metabolism with an area under the curve (AUC) of 83.6, which is superior to currently available scores of blood markers of CAD. Taken together, this work established an in vitro activation assay for the metabolites of AA metabolism, characterized its regulating mechanism and showed its potential for diagnostic testing of patients to the presence of CAD.

Abstract

Eicosanoide sind bedeutende Lipidmediatoren, welche aus Arachidonsäure (AA) nach deren Freisetzung aus Membranphospholipiden durch die Phospholipase A2 (PLA2) gebildet werden können. AA wird anschließend über den Cyclooxygenase (COX-) und Lipoxygenase (LOX-) Stoffwechselweg metabolisiert, wobei eine Reihe von verschiedenen Metaboliten wie Thromboxane, Prostaglandine, Hydroxyeicosatetraensäuren (HETE) sowie Leukotriene entstehen. Eicosanoide haben Einfluss auf die zentralen Prozesse von Entzündungsreaktionen und aufgrund ihrer weit verbreiteten Bildung in Zellen des Blutes sowie des Gefäßsystems spielen diese Metabolite ebenfalls eine Rolle in der Entstehung der Atherosklerose. Die Untersuchung des AA Metabolismus in Vollblut könnte einen neuen Parameter für atherosklerotische Veränderungen darstellen und ist somit prädestiniert als Biomarker für die Diagnostik und Prädiktion einer Koronaren Herzerkrankung (KHK). In Vorarbeiten unserer Gruppe entwickelten wir einen in vitro Assay, bei dem Vollblut von Patienten mit 1 µg/ml Lipopolysaccharid (LPS) für 24 Stunden stimuliert wurde. Die Proben wurden anschließend zentrifugiert und die Metabolite des AA Metabolismus (AA, 5-HETE, 11-HETE, 12-HETE, Prostaglandin F2α (PGF2α), Prostaglandin E2 (PGE2) und Thromboxan B2 (TxB2)) in den Überständen mittels Flüssigchromatografie und Tandem-Massenspektrometrie analysiert sowie quantifiziert. Des Weiteren wurde mRNA (messenger RNA) für quantitative Genexpressionsanalysen der COX-2 sowie Prostaglandin E-Synthase (PGES) aus den zellulären Bestandteilen des Ansatzes isoliert. Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit entwickelten wir das in vitro Vollblutmodel weiter und etablierten zusätzliche Assays für PLA2, COX-1, Prostaglandin F-Synthase (PGFS), Thromboxansynthase (TXAS), 5-LOX, 5-LOX aktivierendes Protein (FLAP) und 12-LOX Genexpressionsanalysen, um so alle Hauptwege des AA Metabolismus abzudecken und das diskriminierende Potential dieser Stoffwechselwege für entzündliche Erkrankungen zu untersuchen. Des Weiteren wurden verschiedene Stimulanzien (LPS, Tumornekrosefaktor Alpha und oxidiertes Low-Density-Lipoprotein) für die Vollblutaktivierung ausgetestet. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die stärksten Effekte LPS-vermittelt waren und eine ausgeprägte Zeit- jedoch keine Dosisabhängigkeit aufwiesen. Da wir eine sehr schnelle Eicosanoidantwort auf den inflammatorischen Stimulus beobachten konnten, fragten wir uns, ob die Eicosanoidantwort auf Genexpressions- und Metabolitenebene bereits vorhanden ist oder einer de novo Synthese unterliegt. Um die regulatorischen Mechanismen besser zu charakterisieren, führten wir Experimente zur Transkriptions- und Translationshemmung durch. Die Daten suggerierten, dass die Produktion der Metabolite einer de novo Synthese nach Stimulation unterliegen, welche sowohl auf der Ebene der Transkription als auch Translation kontrolliert wird. Wir verwendeten nun das neue in vitro Vollblutmodel an, um zu testen, wie hoch die Variabilität des LPS-abhängigen AA Metabolismus in gesunden Individuen ist. Wir konnten große interindividuelle Unterschiede für alle von uns untersuchten Zielgene sowie -metaboliten aufzeigen und nahmen an, dass diese variierende Eicosanoidantwort prädisponierend für die Suszeptibilität für entzündliche Erkrankungen sein könnte. Das prädiktive Potential der individuellen Eicosanoidantwort für das Vorhandensein von Atherosklerose wurde in 92 Probanden mit und ohne KHK mittels des neu entwickelten Vollblutassays geprüft. Wir fanden signifikante Unterschiede (P<0.05) in der Eicosanoidanwort sowohl auf Genexpressions- (COX-1, COX-2, PGES und FLAP) als auch auf Metabolitenebene (AA, 5-, 11- and 12-HETE) zwischen Patienten mit und ohne KHK. Diese Daten erlaubten die Entwicklung eine Scores, welcher aus 3 Biomarkern des AA Metabolismus besteht, eine AUC von 83.6 aufweist und bereits publizierten Scores mit Blutbiomarkern für die Prädiktion einer KHK überlegen ist. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein in vitro Aktivierungsassay für die Metabolite des Arachidonsäuremetabolismus entwickelt, es wurden die zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen charakterisiert sowie das Potential dieses Stoffwechselweges zur diagnostischen Testung von Patienten hinsichtlich dem Vorliegen einer KHK aufgezeigt.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 9. Mai 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Holdt, Lesca