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Anwendungsmöglichkeiten der ex-vivo konfokalen Laserscanmikroskopie in der Dermatologie bei verschiedenen Tumorentitäten
Anwendungsmöglichkeiten der ex-vivo konfokalen Laserscanmikroskopie in der Dermatologie bei verschiedenen Tumorentitäten
Die ex-vivo konfokale Laserscanmikroskopie ist eine neuartige Methode, um frische Gewebeproben der Haut innerhalb kürzester Zeit auf Zellebene zu untersuchen. Sie kann somit als ergänzende bzw. alternative Methode zur konventionellen histopathologischen Untersuchung angesehen werden. Es wurden bereits zahlreiche Studien zur perioperativen Detektion von Basalzellkarzinomen und Plattenepithelkarzinomen in der mikroskopisch kontrollierten Chirurgie („Mohs Surgery“) mittels ex-vivo KLM durchgeführt. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Untersuchung von Anwendungsmöglichkeiten der ex-vivo KLM bei verschiedenen Tumorentitäten und vergleicht die Methode mit der konventionellen histopathologischen Untersuchung, dem aktuellen Goldstandard. Ziel der gesamten Forschungsarbeiten war es, die Tumordickenmessung mittels ex- vivo KLM mit der histopathologischen Messung zu vergleichen sowie die Möglichkeit der spezifischen Detektion der Tumorzellen in immunhistochemisch gefärbten Präparaten von Hauttumoren mittels ex-vivo KLM zu beweisen. Für die Studie „Correlation of histological and ex-vivo confocal tumor thickness in malignant melanoma" wurden insgesamt zehn Hauttumorproben untersucht. Es zeigte sich sowohl in der graphischen Korrelationskurve als auch bei der Berechnung des Spearman Korrelationskoeffizienten mit dem Ergebnis 1,00 eine hohe Übereinstimmung der beiden Testmethoden. Des Weiteren konnten in einem Bland- Altman-Diagramm die Differenzen der beiden Messmethoden gegen den Mittelwert der beiden Methoden aufgetragen werden und zeigten auch hier nur geringe Unterschiede der mittleren Differenz von 0,09 ± 0,30 mm beim Vergleich von RM- CTT und HTT sowie von 0,19 ± 0,35 mm beim Vergleich von FM-CTT und HTT. Die Entscheidung über die Resektionsgröße der Sicherheitsabstände und Sentinel- Lymphknoten-Exstirpation stimmte bei der ex-vivo KLM in allen Fällen mit der konventionellen Histopathologie überein. Die ermittelten Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass die ex-vivo KLM eine Option für die intra-/perioperative Tumordickenmessung beim malignen Melanom sein könnte. Die Tumordicke nach Breslow entscheidet maßgeblich darüber, in welchem Umfang Sicherheitsabstände bei Resektion eingehalten und Sentinel-Lymphknoten-Exstirpationen durchgeführt werden müssen. Eine bereits intraoperative Tumordickenmessung mittels ex-vivo KLM könnte folglich dem Patienten eine erneute Operation mit allen Unannehmlichkeiten ersparen. Für die Studie „Immunofluorescence and confocal microscopy for ex-vivo diagnosis of melanocytic and non-melanocytic skin tumors: A pilot study" wurden insgesamt 50 Tumorgewebeproben nach unterschiedlichen immunhistochemischen Färbeprotokollen und Verdünnungen präpariert und anschließend die Signalstärke mittels ex-vivo KLM nach einem Punktevergabesystem bewertet. Die Immunfärbung mit S100 bei Metastasen des malignen Melanoms war in 55,6 % der Fälle positiv und am besten mittels Färbeprotokoll B (PBS, ohne Blockierungsagens) in einer Verdünnung des Antikörpers von 1:200 darstellbar. Seite | 14 In 66,7 % und ebenfalls nach Protokoll B (PBS, ohne Blockierungsagens) mit einer idealen Verdünnung von 1:500 war die Färbung mit dem fluoreszenzmarkierten Melan A Antikörper bei Metastasen des malignen Melanoms positiv. Die Ber-EP4 Immunfärbung konnte beim Basalzellkarzinom die höchsten Ergebnisse mit einer Nachweisrate von 85,7 % aufweisen. Hierbei war das Färbeprotokoll A (PBS, mit Blockierungsagens) mit einer Verdünnung des Antikörpers von 1:200 und 1:500 am besten geeignet. Folglich konnte gezeigt werden, dass fluoreszenzmarkierte Antikörper auch in der ex- vivo KLM angewendet werden können und somit möglicherweise eine zukünftige Verbesserung der bereits intraoperativen Hauttumordiagnostik möglich ist. Durch die Bindung der Antikörper an spezifische Zellen können Hauttumore mit einer höheren Sicherheit diagnostiziert und differenziert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die ex-vivo KLM eine vielversprechende Methode darstellt, um unter anderem bereits intraoperativ Hauttumore schneller zu evaluieren und dadurch die leitliniengerechte Therapie frühzeitiger anzuwenden. Eine Ausweitung der Studiengröße sowie die Untersuchung weiterer dermatologischer Erkrankungen ist das Ziel für die Zukunft, denn die ex-vivo KLM könnte zahlreiche medizinische, finanzielle und soziale Vorteile mit sich bringen., The ex-vivo confocal laser scanning (CLSM) microscopy is a novel method to examine fresh tissue samples of the skin on a cellular level within a very short time. It can thus be regarded as a supplementary or alternative method of conventional histopathological examination. Numerous studies on perioperative detection of basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma in microscopic controlled surgery (Mohs Surgery) have been performed by ex-vivo CLSM. This dissertation deals with the investigation of various applications of ex-vivo CLSM in various tumor entities and compares the method with conventional histopathological examination, the current gold standard. The aim of the research work was to compare the tumor thickness measurement by ex-vivo CLSM with the histopathological measurement and to prove the possibility of detecting immunohistochemically stained preparations of skin tumors using ex-vivo CLSM. For the study "Correlation of histological and ex-vivo confocal tumor thickness in malignant melanoma" a total of ten skin tumor samples were examined, showing a high correlation between the two different measurement methods both in the graph correlation curve and the calculation of the Spearman correlation coefficient with the result 1.00. Furthermore, in a Bland-Altman diagram, the differences between the two methods were plotted against the mean of the two methods and again showed only slight differences in the mean difference of 0.09 ± 0.30 mm when comparing RM-CTT and HTT and 0.19 ± 0.35 mm comparing FM-CTT and HTT. The decision on the resection size of the safety margins and sentinel lymph node extirpation was in all cases of ex-vivo CLSM consistent with conventional histopathology. The results of this study indicated that the measurement of the tumor thickness with ex-vivo CLSM may be a potential alternative to the conventional histopathological tumor thickness measurement in malignant melanoma. The tumor thickness according to Breslow decisively determines the extent of consecutive safety margins and indication for sentinel lymph node biopsy. An intraoperative tumor thickness measurement using ex-vivo CLSM could thus spare the patient a reoperation with all associated inconveniences. For the study "Immunofluorescence and confocal microscopy for ex-vivo diagnosis of melanocytic and non-melanocytic skin tumors: A pilot study" a total of 50 tumor tissue samples were prepared according to different immunohistochemical staining protocols and dilutions, and then the signal strengths were evaluated by ex-vivo CLSM according to a scoring system. The immunostaining with S100 in metastases of the melanoma was positive in 55.6% of cases and best represented by staining protocol B (PBS, without blocking agent) in a dilution of the antibody of 1: 200. In 66.7% and also according to protocol B (PBS, without blocking agent) with an ideal dilution of 1: 500, staining with the fluorescence-labeled Melan A antibody was positive in metastases of the melanoma. Seite | 16 The Ber-EP4 immunostaining showed the highest results in basal cell carcinoma with a detection rate of 85.7%. Here, the staining protocol A (PBS, with blocking agent) with a dilution of the antibody of 1: 200 and 1: 500 was most suitable. Consequently, it could be shown that fluorescence-labeled antibodies can also be used in the ex-vivo CLSM. This may lead to a future improvement of intraoperative skin tumor diagnostics. By binding the antibodies to specific cells, skin tumors can be diagnosed and differentiated with a higher accuracy. In summary, the ex-vivo CLSM represents a promising method for faster intraoperative evaluation of skin tumors and thus immediate application of a guideline-based therapy. An expansion of the studies as well as investigation of further dermatological diseases are the goals for the future, since ex-vivo CLSM may bring numerous medical, financial and social benefits.
Konfokale Laserscanmikroskopie, Immunfluoreszenz, Tumordicke, Malignes Melanom, Dermatologie
Krammer, Sebastian
2019
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Krammer, Sebastian (2019): Anwendungsmöglichkeiten der ex-vivo konfokalen Laserscanmikroskopie in der Dermatologie bei verschiedenen Tumorentitäten. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Die ex-vivo konfokale Laserscanmikroskopie ist eine neuartige Methode, um frische Gewebeproben der Haut innerhalb kürzester Zeit auf Zellebene zu untersuchen. Sie kann somit als ergänzende bzw. alternative Methode zur konventionellen histopathologischen Untersuchung angesehen werden. Es wurden bereits zahlreiche Studien zur perioperativen Detektion von Basalzellkarzinomen und Plattenepithelkarzinomen in der mikroskopisch kontrollierten Chirurgie („Mohs Surgery“) mittels ex-vivo KLM durchgeführt. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Untersuchung von Anwendungsmöglichkeiten der ex-vivo KLM bei verschiedenen Tumorentitäten und vergleicht die Methode mit der konventionellen histopathologischen Untersuchung, dem aktuellen Goldstandard. Ziel der gesamten Forschungsarbeiten war es, die Tumordickenmessung mittels ex- vivo KLM mit der histopathologischen Messung zu vergleichen sowie die Möglichkeit der spezifischen Detektion der Tumorzellen in immunhistochemisch gefärbten Präparaten von Hauttumoren mittels ex-vivo KLM zu beweisen. Für die Studie „Correlation of histological and ex-vivo confocal tumor thickness in malignant melanoma" wurden insgesamt zehn Hauttumorproben untersucht. Es zeigte sich sowohl in der graphischen Korrelationskurve als auch bei der Berechnung des Spearman Korrelationskoeffizienten mit dem Ergebnis 1,00 eine hohe Übereinstimmung der beiden Testmethoden. Des Weiteren konnten in einem Bland- Altman-Diagramm die Differenzen der beiden Messmethoden gegen den Mittelwert der beiden Methoden aufgetragen werden und zeigten auch hier nur geringe Unterschiede der mittleren Differenz von 0,09 ± 0,30 mm beim Vergleich von RM- CTT und HTT sowie von 0,19 ± 0,35 mm beim Vergleich von FM-CTT und HTT. Die Entscheidung über die Resektionsgröße der Sicherheitsabstände und Sentinel- Lymphknoten-Exstirpation stimmte bei der ex-vivo KLM in allen Fällen mit der konventionellen Histopathologie überein. Die ermittelten Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass die ex-vivo KLM eine Option für die intra-/perioperative Tumordickenmessung beim malignen Melanom sein könnte. Die Tumordicke nach Breslow entscheidet maßgeblich darüber, in welchem Umfang Sicherheitsabstände bei Resektion eingehalten und Sentinel-Lymphknoten-Exstirpationen durchgeführt werden müssen. Eine bereits intraoperative Tumordickenmessung mittels ex-vivo KLM könnte folglich dem Patienten eine erneute Operation mit allen Unannehmlichkeiten ersparen. Für die Studie „Immunofluorescence and confocal microscopy for ex-vivo diagnosis of melanocytic and non-melanocytic skin tumors: A pilot study" wurden insgesamt 50 Tumorgewebeproben nach unterschiedlichen immunhistochemischen Färbeprotokollen und Verdünnungen präpariert und anschließend die Signalstärke mittels ex-vivo KLM nach einem Punktevergabesystem bewertet. Die Immunfärbung mit S100 bei Metastasen des malignen Melanoms war in 55,6 % der Fälle positiv und am besten mittels Färbeprotokoll B (PBS, ohne Blockierungsagens) in einer Verdünnung des Antikörpers von 1:200 darstellbar. Seite | 14 In 66,7 % und ebenfalls nach Protokoll B (PBS, ohne Blockierungsagens) mit einer idealen Verdünnung von 1:500 war die Färbung mit dem fluoreszenzmarkierten Melan A Antikörper bei Metastasen des malignen Melanoms positiv. Die Ber-EP4 Immunfärbung konnte beim Basalzellkarzinom die höchsten Ergebnisse mit einer Nachweisrate von 85,7 % aufweisen. Hierbei war das Färbeprotokoll A (PBS, mit Blockierungsagens) mit einer Verdünnung des Antikörpers von 1:200 und 1:500 am besten geeignet. Folglich konnte gezeigt werden, dass fluoreszenzmarkierte Antikörper auch in der ex- vivo KLM angewendet werden können und somit möglicherweise eine zukünftige Verbesserung der bereits intraoperativen Hauttumordiagnostik möglich ist. Durch die Bindung der Antikörper an spezifische Zellen können Hauttumore mit einer höheren Sicherheit diagnostiziert und differenziert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die ex-vivo KLM eine vielversprechende Methode darstellt, um unter anderem bereits intraoperativ Hauttumore schneller zu evaluieren und dadurch die leitliniengerechte Therapie frühzeitiger anzuwenden. Eine Ausweitung der Studiengröße sowie die Untersuchung weiterer dermatologischer Erkrankungen ist das Ziel für die Zukunft, denn die ex-vivo KLM könnte zahlreiche medizinische, finanzielle und soziale Vorteile mit sich bringen.

Abstract

The ex-vivo confocal laser scanning (CLSM) microscopy is a novel method to examine fresh tissue samples of the skin on a cellular level within a very short time. It can thus be regarded as a supplementary or alternative method of conventional histopathological examination. Numerous studies on perioperative detection of basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma in microscopic controlled surgery (Mohs Surgery) have been performed by ex-vivo CLSM. This dissertation deals with the investigation of various applications of ex-vivo CLSM in various tumor entities and compares the method with conventional histopathological examination, the current gold standard. The aim of the research work was to compare the tumor thickness measurement by ex-vivo CLSM with the histopathological measurement and to prove the possibility of detecting immunohistochemically stained preparations of skin tumors using ex-vivo CLSM. For the study "Correlation of histological and ex-vivo confocal tumor thickness in malignant melanoma" a total of ten skin tumor samples were examined, showing a high correlation between the two different measurement methods both in the graph correlation curve and the calculation of the Spearman correlation coefficient with the result 1.00. Furthermore, in a Bland-Altman diagram, the differences between the two methods were plotted against the mean of the two methods and again showed only slight differences in the mean difference of 0.09 ± 0.30 mm when comparing RM-CTT and HTT and 0.19 ± 0.35 mm comparing FM-CTT and HTT. The decision on the resection size of the safety margins and sentinel lymph node extirpation was in all cases of ex-vivo CLSM consistent with conventional histopathology. The results of this study indicated that the measurement of the tumor thickness with ex-vivo CLSM may be a potential alternative to the conventional histopathological tumor thickness measurement in malignant melanoma. The tumor thickness according to Breslow decisively determines the extent of consecutive safety margins and indication for sentinel lymph node biopsy. An intraoperative tumor thickness measurement using ex-vivo CLSM could thus spare the patient a reoperation with all associated inconveniences. For the study "Immunofluorescence and confocal microscopy for ex-vivo diagnosis of melanocytic and non-melanocytic skin tumors: A pilot study" a total of 50 tumor tissue samples were prepared according to different immunohistochemical staining protocols and dilutions, and then the signal strengths were evaluated by ex-vivo CLSM according to a scoring system. The immunostaining with S100 in metastases of the melanoma was positive in 55.6% of cases and best represented by staining protocol B (PBS, without blocking agent) in a dilution of the antibody of 1: 200. In 66.7% and also according to protocol B (PBS, without blocking agent) with an ideal dilution of 1: 500, staining with the fluorescence-labeled Melan A antibody was positive in metastases of the melanoma. Seite | 16 The Ber-EP4 immunostaining showed the highest results in basal cell carcinoma with a detection rate of 85.7%. Here, the staining protocol A (PBS, with blocking agent) with a dilution of the antibody of 1: 200 and 1: 500 was most suitable. Consequently, it could be shown that fluorescence-labeled antibodies can also be used in the ex-vivo CLSM. This may lead to a future improvement of intraoperative skin tumor diagnostics. By binding the antibodies to specific cells, skin tumors can be diagnosed and differentiated with a higher accuracy. In summary, the ex-vivo CLSM represents a promising method for faster intraoperative evaluation of skin tumors and thus immediate application of a guideline-based therapy. An expansion of the studies as well as investigation of further dermatological diseases are the goals for the future, since ex-vivo CLSM may bring numerous medical, financial and social benefits.