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Systematische Evaluation und Optimierung physikalischer und prozeduraler Dezellularisationsmethoden zur Herstellung xenogener Gewebeprothesen
Systematische Evaluation und Optimierung physikalischer und prozeduraler Dezellularisationsmethoden zur Herstellung xenogener Gewebeprothesen
Während der vergangenen Jahre hat die Verwendung dezellularisierter Gewebeprothesen in der Medizin kontinuierlich zugenommen. Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit wurden ausgewählte physikalische und prozedurale Methoden zur Dezellularisation (DZ) biologischer Gewebe systematisch untersucht und bewertet. 72 Aortenwände (AW) frischer Schweineherzen wurden dafür in drei verschiedenen Gruppen einer chemischen Dezellularisationslösung, bestehend aus je 0,5 % Sodiumdeoxycholat und Sodiumdodecylsulfat, für 4 h oder 8 h ausgesetzt. Die Inkubation fand entweder kontinuierlich oder in repetitiven Behandlungszyklen statt. Ein Zyklus bestand dabei aus je 2 h chemischer Behandlung gefolgt von einem 30 min Waschvorgang mit Natriumchlorid-Lösung (NaCl). Während der Prozeduren befanden sich die AW entweder in einem konventionellen Schüttel-Inkubator oder wurden einer zirkulären Strömungsbewegung im Sinne einer Flussdezellularisation ausgesetzt. Zusätzlich zur Flussdezellularisation wurde ein Teil der AW mit Ultraschallwellen behandelt. Nach Abschluss der DZ durchliefen alle AW zehn repetitive 15 min Waschschritte mit NaCl. Basierend auf der Annahme, dass erfolgreiche DZ gleichzusetzen ist mit der Abwesenheit von Zellkernen bei gleichzeitigem Erhalt intakter Extrazellulärmatrix (EZM), wurde die Auswertung der DZ Ergebnisse durchgeführt. Diese erfolgte mithilfe fluoreszenz-, licht-, und rasterelektronenmikroskopischer Aufnahmen der Proben. Die Effektivität der DZ wurde dabei anhand der zur Probenoberfläche erreichten Eindringtiefen (EDT) an DNA-Eradikation in Färbungen mit 4',6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) und Hämatoxylin-Eosin bewertet. Zur Beurteilung der EZM dienten die Bindegewebsfärbungen Movat Pentachrom und Pikro-Siriusrot sowie die Rasterelektronenmikroskopie (REM). Generell waren die nach 4 h und 8 h eruierten EDT der äußeren Oberflächen der AW signifikant höher als die der lumenseitigen Oberflächen (64 ± 22%, p<0,001). Darüber hinaus konnte eine signifikante Zeitabhängigkeit der EDT sowohl an äußerer (78 ± 36%, p<0,001) als auch innerer Oberfläche (85 ± 58%, p<0,001) gezeigt werden. Verglichen mit der kontinuierlichen Schüttelmethode führte der Einsatz von zyklischen Inkubationsschemata (Maximum: 43 %, p<0,001), Flussbewegung (Maximum: 19 %, p<0,05) und Ultraschall (Maximum: 49 %, p<0,001) zu signifikant höheren EDT. Der Erhalt der physiologischen Gewebekomposition sowie des kollagenen Fasernetzwerkes der EZM wurde für alle Versuchsproben mithilfe der histologischen Bindegewebsfärbungen bewiesen. Die Auswertung der REM-Aufnahmen zeigte ein skelettiertes, aber intaktes Fasernetzwerk der AW. Basierend auf den gewonnen Ergebnissen wurden 6 AW für 24 h zyklisch Flussdezellularisation und intermittierender Ultraschallbehandlung ausgesetzt. Als Vergleichskollektiv hierzu wurden 6 AW im Schüttelinkubator ebenfalls für 24 h behandelt. Die Auswertung dieser beiden Gruppen bestätigte die vorherigen Ergebnisse. So führten auch hier intermittierende Waschschritte, Flussbewegung und Ultraschallexposition zu signifikant höheren EDT an äußerer (30 %, p<0,001) und innerer Oberfläche (23 %, p<0,001). Darüber hinaus konnten an den äußeren Oberflächen der AW erneut höhere EDT (45 ± 18%, p<0,001) verzeichnet, sowie die bereits postulierte Zeitabhängigkeit der EDT bestätigt werden. Hierbei zeigte sich auch, dass die Eindringgeschwindigkeit mit zunehmender Expositionszeit abnahm. Dies wurde im Sinne einer mit steigender EDT verminderten Effektivität der Behandlungsprozedur erklärt. Histologische und REM Aufnahmen lieferten in den 24 h behandelten Proben ebenfalls keine Hinweise auf prozessbedingte Schäden der Gewebestruktur. Zusammenfassend erlaubte unsere systematische Evaluation entscheidende Faktoren für effektivere DZ Prozeduren zu identifizieren und zu beurteilen. Basierend auf unseren Ergebnissen empfehlen wir für zukünftige DZ Protokolle ausdrücklich die Verwendung von zyklischen Inkubationsschemata sowie eine Kombination aus Flussdezellularsiation und Ultraschallbehandlung.
Dezellularisation, physikalisch, prozedural, xenogen
Starnecker, Fabian
2019
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Starnecker, Fabian (2019): Systematische Evaluation und Optimierung physikalischer und prozeduraler Dezellularisationsmethoden zur Herstellung xenogener Gewebeprothesen. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Während der vergangenen Jahre hat die Verwendung dezellularisierter Gewebeprothesen in der Medizin kontinuierlich zugenommen. Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit wurden ausgewählte physikalische und prozedurale Methoden zur Dezellularisation (DZ) biologischer Gewebe systematisch untersucht und bewertet. 72 Aortenwände (AW) frischer Schweineherzen wurden dafür in drei verschiedenen Gruppen einer chemischen Dezellularisationslösung, bestehend aus je 0,5 % Sodiumdeoxycholat und Sodiumdodecylsulfat, für 4 h oder 8 h ausgesetzt. Die Inkubation fand entweder kontinuierlich oder in repetitiven Behandlungszyklen statt. Ein Zyklus bestand dabei aus je 2 h chemischer Behandlung gefolgt von einem 30 min Waschvorgang mit Natriumchlorid-Lösung (NaCl). Während der Prozeduren befanden sich die AW entweder in einem konventionellen Schüttel-Inkubator oder wurden einer zirkulären Strömungsbewegung im Sinne einer Flussdezellularisation ausgesetzt. Zusätzlich zur Flussdezellularisation wurde ein Teil der AW mit Ultraschallwellen behandelt. Nach Abschluss der DZ durchliefen alle AW zehn repetitive 15 min Waschschritte mit NaCl. Basierend auf der Annahme, dass erfolgreiche DZ gleichzusetzen ist mit der Abwesenheit von Zellkernen bei gleichzeitigem Erhalt intakter Extrazellulärmatrix (EZM), wurde die Auswertung der DZ Ergebnisse durchgeführt. Diese erfolgte mithilfe fluoreszenz-, licht-, und rasterelektronenmikroskopischer Aufnahmen der Proben. Die Effektivität der DZ wurde dabei anhand der zur Probenoberfläche erreichten Eindringtiefen (EDT) an DNA-Eradikation in Färbungen mit 4',6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) und Hämatoxylin-Eosin bewertet. Zur Beurteilung der EZM dienten die Bindegewebsfärbungen Movat Pentachrom und Pikro-Siriusrot sowie die Rasterelektronenmikroskopie (REM). Generell waren die nach 4 h und 8 h eruierten EDT der äußeren Oberflächen der AW signifikant höher als die der lumenseitigen Oberflächen (64 ± 22%, p<0,001). Darüber hinaus konnte eine signifikante Zeitabhängigkeit der EDT sowohl an äußerer (78 ± 36%, p<0,001) als auch innerer Oberfläche (85 ± 58%, p<0,001) gezeigt werden. Verglichen mit der kontinuierlichen Schüttelmethode führte der Einsatz von zyklischen Inkubationsschemata (Maximum: 43 %, p<0,001), Flussbewegung (Maximum: 19 %, p<0,05) und Ultraschall (Maximum: 49 %, p<0,001) zu signifikant höheren EDT. Der Erhalt der physiologischen Gewebekomposition sowie des kollagenen Fasernetzwerkes der EZM wurde für alle Versuchsproben mithilfe der histologischen Bindegewebsfärbungen bewiesen. Die Auswertung der REM-Aufnahmen zeigte ein skelettiertes, aber intaktes Fasernetzwerk der AW. Basierend auf den gewonnen Ergebnissen wurden 6 AW für 24 h zyklisch Flussdezellularisation und intermittierender Ultraschallbehandlung ausgesetzt. Als Vergleichskollektiv hierzu wurden 6 AW im Schüttelinkubator ebenfalls für 24 h behandelt. Die Auswertung dieser beiden Gruppen bestätigte die vorherigen Ergebnisse. So führten auch hier intermittierende Waschschritte, Flussbewegung und Ultraschallexposition zu signifikant höheren EDT an äußerer (30 %, p<0,001) und innerer Oberfläche (23 %, p<0,001). Darüber hinaus konnten an den äußeren Oberflächen der AW erneut höhere EDT (45 ± 18%, p<0,001) verzeichnet, sowie die bereits postulierte Zeitabhängigkeit der EDT bestätigt werden. Hierbei zeigte sich auch, dass die Eindringgeschwindigkeit mit zunehmender Expositionszeit abnahm. Dies wurde im Sinne einer mit steigender EDT verminderten Effektivität der Behandlungsprozedur erklärt. Histologische und REM Aufnahmen lieferten in den 24 h behandelten Proben ebenfalls keine Hinweise auf prozessbedingte Schäden der Gewebestruktur. Zusammenfassend erlaubte unsere systematische Evaluation entscheidende Faktoren für effektivere DZ Prozeduren zu identifizieren und zu beurteilen. Basierend auf unseren Ergebnissen empfehlen wir für zukünftige DZ Protokolle ausdrücklich die Verwendung von zyklischen Inkubationsschemata sowie eine Kombination aus Flussdezellularsiation und Ultraschallbehandlung.