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Charakterisierung eines Mausmodells zur BH4-sensitiven Phenylketonurie
Charakterisierung eines Mausmodells zur BH4-sensitiven Phenylketonurie
Phenylketonurie (PKU) ist eine angeborene Störung des Aminosäurestoffwechsels, die unbehandelt zu schweren neurologischen Schäden führt. In vielen Fällen ist die einzige mögliche Behandlungsoption eine streng eiweißarme Diät. Im Rahmen klinischer Studien konnte gezeigt werden, dass etwa ein Drittel der Patienten auf die Gabe pharmakologischer Dosen des natürlichen Kofaktors der Phenylalaninhydroxylase (PAH), Tetrahydrobiopterin (BH4), ansprechen (Muntau et al. 2002). Mit der Hilfe von BH4 ergab sich eine Behandlungsalternative, die den Patienten erlaubte ihre Diät zu lockern und mehr natürliches Protein mit der Nahrung aufzunehmen (Muntau et al. 2002). Zentrale Fragestellung der vorliegenden Doktorarbeit war die Identifikation und eingehende Charakterisierung BH4-sensitiver Mausmodelle. Das homozygote Mausmodell Pahenu1/enu1 trägt die Variante p.Val106Ala der murinen Phenylalaninhydroxylase (Pah). Der Aminosäureaustausch beeinträchtigt die regulatorische Domäne und führt zu einem milden PKU-Phänotyp. Das homozygote Mausmodell Pahenu2/enu2 ist Träger der Mutation p.Phe263Ser, die in der katalytischen Domäne des Enzyms gelegen ist und zum klinischen Bild einer schweren PKU führt. Pahenu1/enu2 zeigt als compound-heterozygotes Mausmodell einen intermediären klinischen Phänotyp. Die Aminosäuren Phe 263 und Val 106 sind zwischen der murinen Pah und der humanen PAH konserviert. Wie im entsprechenden Mausmodell führt die Variante p.Val106Ala beim Menschen zu einem milden Phänotyp und p.Phe263Ser zu einem schweren Phänotyp. Bei Analyse der enzymkinetischen Parameter am rekombinanten Protein (Wildtyp, p.Val106Ala, p.Phe263Ser) konnte eine gute Vergleichbarkeit zwischen der murinen und humanen PAH gezeigt werden. Unterschiede in den Enzymaktivitäten zwischen Proben von murinen und humanen Leberlysaten beruhen auf unterschiedlichen hepatischen PAH-Mengen. Die im Rahmen der Arbeit erhobenen Daten zeigten, dass die murine Pah ein gut geeignetes Modell für das PAH-System des Menschen ist. Sowohl für Pahenu1/enu1 als auch für Pahenu1/enu2 konnten wir nachweisen, dass diese Mausmodelle von einer pharmakologischen Therapie mit BH4 profitieren und somit eine BH4-Sensitivität vorliegt. Pahenu2/enu2 zeigte kein Ansprechen auf die BH4-Therapie. Am rekombinant hergestellten Protein führte die Variante p.Val106Ala in vitro weder zu einer Verminderung der Affinität zum Kofaktor noch zu einer Reduktion der spezifischen Enzymaktivität. Somit kann die Wirkung von BH4 nicht durch eine direkte Wirkung als Kofaktor der enzymatischen Reaktion erklärt werden. In biophysikalischen und biochemischen Experimenten an gereinigten Proteinen und im zellulären Modell konnte gezeigt werden, dass die Variante p.Val106Ala zu vermehrter Aggregation und Degradation neigt und damit zu einer Verminderung des intakten Enzyms führt. Auf molekularer Ebene induzierte BH4 eine Korrektur der p.Val106Ala-Proteinfehlfaltung und führte somit, als sogenanntes pharmakologisches Chaperon, zu einer Erhöhung der effektiven intrazellulären Konzentration von korrekt gefalteter und funktionaler Pah. Beim Vergleich der pharmakokinetischen und -dynamischen Parameter einer BH4-Therapie von Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2 haben wir Unterschiede zwischen diesen beiden BH4-sensitiven Mausmodellen festgestellt. Dies zeigt, dass die BH4-Wirkung nicht nur von der BH4-sensitiven Variante (hier p.Val106Ala) bestimmt wird, sondern auch vom zweiten Allel beeinflusst wird. Dieser Effekt der interallelischen Komplementation sollte bei den compound-heterozygoten Patienten berücksichtigt werden und könnte erweiterte Testprotokolle notwendig machen. Im Rahmen der ex vivo Experimente wurden bei nicht diätetisch oder pharmakologisch therapierten Mäusen Unterschiede in den freien, intrazellulären BH4-Konzentrationen zwischen den verschiedenen Mausgenotypen beobachtet. Interessanterweise waren diese Unterschiede der BH4- Konzentration nicht im Blut zu beobachten. Die intrazelluläre BH4-Konzentration von Hepatozyten war bei Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2 im Vergleich zum Wildtyp sowie zu Pahenu2/enu2 erniedrigt. Es konnten keine Unterschiede in der Expression des Schlüsselenzyms der Tetrahydrobiopterin- Biosynthese, Gch1, nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte ein ungehemmter BH4-Verbrauch im Rahmen eines enzymatischen Uncoupling für die Pahenu1-Allel tragenden Mäuse ausgeschlossen werden. Wir konnten in vitro zeigen, dass zwar kein Unterschied in der absoluten BH4-Konzentration vorliegt, jedoch eine Verschiebung innerhalb des BH4-Pools stattfindet, was zu einer Reduktion des freien BH4 führte. Bei Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2, die das Allel p.V106Ala tragen, scheint es in den Hepatozyten zu einer verstärkten Bindung von BH4 an die Pah (trapping) zu kommen, so dass BH4 nicht mehr frei verfügbar in der Zelle vorliegt. Somit kommt es neben dem mutationsbedingten Funktionsverlust der p.Val106Ala-Pah auch zu einem sekundären BH4-Mangel, der zu einer weiteren Verminderung der Enzymaktivität beitragen könnte. Die Gabe von pharmakologischen Dosen von BH4 könnte neben der Korrektur der Proteinfehlfaltung als pharmakologisches Chaperon somit auch einen Ausgleich des sekundären intrazellulären BH4-Mangels bewirken. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen der Krankheitsentstehung und der pharmakologischen Korrektur bei den BH4-sensitiven Mausmodellen Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2 kann dazu beitragen, die pharmakologische Therapie, zum Beispiel durch die Entwicklung von optimierten oder neuen Wirkstoffen, zu verbessern und effizienter zu machen. Darüber hinaus können diese Mausmodelle auch genutzt werden, um grundsätzliche Fragestellungen zu Proteinfehlfaltungserkrankungen und Degradationsmechanismen zu adressieren. So könnten die Mausmodelle bei Untersuchungen der zellulären Degradationsmaschinerie, des Einflusses von oxidativem Stress auf Proteinfaltung und der Korrektur der gestörten Proteinhomöostase mittels Proteostase-Regulatoren verwendet werden., Phenylketonuria (PKU) is an inborn error of amino acid metabolism which causes severe neurological impairment, if untreated. For most patients, a strict low-phenylalanine diet is the only treatment option. In clinical studies, it was shown that approximately one third of the patients respond to supplementation with pharmacological dosages of tetrahydrobiopterin (BH4), which is the natural cofactor of the enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH). Treatment with BH4 gave rise to a pharmacological therapeutic alternative that allows patients to relax their diet and tolerate more natural protein (Muntau et al. 2002). The main topic of this thesis was the identification and the detailed characterization of a BH4-responsive mouse model. The homozygous Pahenu1/enu1 mouse carries the allelic variant p.Val106Ala of murine Pah. The amino acid side chain replacement affects the regulatory domain leading to a mild PKU phenotype. The homozygous Pahenu2/enu2 mouse carries the allelic variant p.Phe263Ser, which maps to the catalytic domain of the enzyme and causes a clinical picture of severe PKU. The compound heterozygous Pahenu1/enu2 mouse shows an intermediate clinical phenotype. The amino acids Phe 263 and Val 106 of the PAH protein are conserved between humans and mice. According to phenotypes observed in mice, p.Val106Ala leads to a mild phenotype in humans and p.Phe263Ser induces classical PKU. Enzyme kinetics analyses using recombinantly expressed protein (wild-type, p.Val106Ala, p.Phe263Ser) showed good comparability between human and murine PAH. The differences between the activity of human and murine PAH in the liver tissues seemed to be due to different intrahepatic PAH amounts. The data presented here shows that murine Pah is an appropriate model for the human phenylalanine hydroxylating system. Both Pahenu1/enu1 and Pahenu1/enu2 showed BH4 responsiveness and benefit from treatment with BH4, whereas Pahenu2/enu2 showed no response to BH4 treatment. In vitro, the recombinantly expressed p.Val106Ala protein showed neither a reduction of affinity to its cofactor BH4 nor a marked reduction in specific enzyme activity. Thus, BH4 responsiveness cannot be explained by a direct cofactor effect on the enzymatic reaction. Detailed biophysical and biochemical investigation using purified protein and eukaryotically expressed protein showed propensity towards degradation and aggregation for p.Val106Ala, leading to a decrease in the available amount of functional protein. On a molecular level, BH4 rescued protein misfolding of p.Val106Ala, acting as a pharmacological chaperone. BH4 enhanced the amount of correctly folded and enzymatically active Pah. Comparison of pharmacokinetics and pharmacodynamics of BH4 therapy in Pahenu1/enu1 and Pahenu1/enu2 showed differences between genotypes. The BH4 effect is not only determined by one allele, e.g. a BH4- responsive variant (here p.Val106Ala), but also by the second allele (p.Val106Ala or null mutation p.Phe263Ser). These differences in response to the BH4 therapy may lead to the need for expanded testing in compound heterozygous patients. In ex vivo analyses, we observed differences in hepatic free intracellular BH4 between untreated genotypes. Interestingly, this was not congruent with the BH4 pattern in blood. The BH4 concentration in hepatocytes was decreased for Pahenu1/enu1 and Pahenu1/enu2 in comparison to the wild- type and Pahenu2/enu2. No differences were found in the expression of Gch1, the key enzyme of tetrahydrobiopterin biosynthesis. Moreover, no increase in the consumption of BH4 due to enzymatic uncoupling was observed for genotypes carrying the Pahenu1 allele. We demonstrated in vitro that the total amount of BH4 was not altered, but a shift in BH4 pools led to a decrease in free BH4. Misfolded p.Val106Ala Pah protein trapped BH4 making it unavailable for the enzymatic reaction. In addition to the loss of function due to the mutation p.Val106Ala, this mechanism may lead to secondary intracellular BH4 deficiency, which induces a further decrease in enzyme function. Therefore, therapeutic BH4 may not only exert a pharmacological chaperone effect on the misfolded p.Val106Ala protein, the treatment may also correct intrahepatic secondary BH4 deficiency. A better understanding of the molecular mechanisms of BH4-responsive PKU could lead to optimization of the current therapy with BH4 and might enable the identification of new and more efficient pharmacological compounds. Moreover, mice carrying the Pahenu1 allele could be used to address more general questions regarding diseases with protein misfolding and degradation. For example, the mouse model could help to elucidate mechanisms of intracellular protein degradation, the impact of oxidative stress on protein misfolding and therapeutic routes to correct protein homeostasis by proteostasis regulation.
Not available
Eichinger, Anna
2019
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Eichinger, Anna (2019): Charakterisierung eines Mausmodells zur BH4-sensitiven Phenylketonurie. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Phenylketonurie (PKU) ist eine angeborene Störung des Aminosäurestoffwechsels, die unbehandelt zu schweren neurologischen Schäden führt. In vielen Fällen ist die einzige mögliche Behandlungsoption eine streng eiweißarme Diät. Im Rahmen klinischer Studien konnte gezeigt werden, dass etwa ein Drittel der Patienten auf die Gabe pharmakologischer Dosen des natürlichen Kofaktors der Phenylalaninhydroxylase (PAH), Tetrahydrobiopterin (BH4), ansprechen (Muntau et al. 2002). Mit der Hilfe von BH4 ergab sich eine Behandlungsalternative, die den Patienten erlaubte ihre Diät zu lockern und mehr natürliches Protein mit der Nahrung aufzunehmen (Muntau et al. 2002). Zentrale Fragestellung der vorliegenden Doktorarbeit war die Identifikation und eingehende Charakterisierung BH4-sensitiver Mausmodelle. Das homozygote Mausmodell Pahenu1/enu1 trägt die Variante p.Val106Ala der murinen Phenylalaninhydroxylase (Pah). Der Aminosäureaustausch beeinträchtigt die regulatorische Domäne und führt zu einem milden PKU-Phänotyp. Das homozygote Mausmodell Pahenu2/enu2 ist Träger der Mutation p.Phe263Ser, die in der katalytischen Domäne des Enzyms gelegen ist und zum klinischen Bild einer schweren PKU führt. Pahenu1/enu2 zeigt als compound-heterozygotes Mausmodell einen intermediären klinischen Phänotyp. Die Aminosäuren Phe 263 und Val 106 sind zwischen der murinen Pah und der humanen PAH konserviert. Wie im entsprechenden Mausmodell führt die Variante p.Val106Ala beim Menschen zu einem milden Phänotyp und p.Phe263Ser zu einem schweren Phänotyp. Bei Analyse der enzymkinetischen Parameter am rekombinanten Protein (Wildtyp, p.Val106Ala, p.Phe263Ser) konnte eine gute Vergleichbarkeit zwischen der murinen und humanen PAH gezeigt werden. Unterschiede in den Enzymaktivitäten zwischen Proben von murinen und humanen Leberlysaten beruhen auf unterschiedlichen hepatischen PAH-Mengen. Die im Rahmen der Arbeit erhobenen Daten zeigten, dass die murine Pah ein gut geeignetes Modell für das PAH-System des Menschen ist. Sowohl für Pahenu1/enu1 als auch für Pahenu1/enu2 konnten wir nachweisen, dass diese Mausmodelle von einer pharmakologischen Therapie mit BH4 profitieren und somit eine BH4-Sensitivität vorliegt. Pahenu2/enu2 zeigte kein Ansprechen auf die BH4-Therapie. Am rekombinant hergestellten Protein führte die Variante p.Val106Ala in vitro weder zu einer Verminderung der Affinität zum Kofaktor noch zu einer Reduktion der spezifischen Enzymaktivität. Somit kann die Wirkung von BH4 nicht durch eine direkte Wirkung als Kofaktor der enzymatischen Reaktion erklärt werden. In biophysikalischen und biochemischen Experimenten an gereinigten Proteinen und im zellulären Modell konnte gezeigt werden, dass die Variante p.Val106Ala zu vermehrter Aggregation und Degradation neigt und damit zu einer Verminderung des intakten Enzyms führt. Auf molekularer Ebene induzierte BH4 eine Korrektur der p.Val106Ala-Proteinfehlfaltung und führte somit, als sogenanntes pharmakologisches Chaperon, zu einer Erhöhung der effektiven intrazellulären Konzentration von korrekt gefalteter und funktionaler Pah. Beim Vergleich der pharmakokinetischen und -dynamischen Parameter einer BH4-Therapie von Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2 haben wir Unterschiede zwischen diesen beiden BH4-sensitiven Mausmodellen festgestellt. Dies zeigt, dass die BH4-Wirkung nicht nur von der BH4-sensitiven Variante (hier p.Val106Ala) bestimmt wird, sondern auch vom zweiten Allel beeinflusst wird. Dieser Effekt der interallelischen Komplementation sollte bei den compound-heterozygoten Patienten berücksichtigt werden und könnte erweiterte Testprotokolle notwendig machen. Im Rahmen der ex vivo Experimente wurden bei nicht diätetisch oder pharmakologisch therapierten Mäusen Unterschiede in den freien, intrazellulären BH4-Konzentrationen zwischen den verschiedenen Mausgenotypen beobachtet. Interessanterweise waren diese Unterschiede der BH4- Konzentration nicht im Blut zu beobachten. Die intrazelluläre BH4-Konzentration von Hepatozyten war bei Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2 im Vergleich zum Wildtyp sowie zu Pahenu2/enu2 erniedrigt. Es konnten keine Unterschiede in der Expression des Schlüsselenzyms der Tetrahydrobiopterin- Biosynthese, Gch1, nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte ein ungehemmter BH4-Verbrauch im Rahmen eines enzymatischen Uncoupling für die Pahenu1-Allel tragenden Mäuse ausgeschlossen werden. Wir konnten in vitro zeigen, dass zwar kein Unterschied in der absoluten BH4-Konzentration vorliegt, jedoch eine Verschiebung innerhalb des BH4-Pools stattfindet, was zu einer Reduktion des freien BH4 führte. Bei Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2, die das Allel p.V106Ala tragen, scheint es in den Hepatozyten zu einer verstärkten Bindung von BH4 an die Pah (trapping) zu kommen, so dass BH4 nicht mehr frei verfügbar in der Zelle vorliegt. Somit kommt es neben dem mutationsbedingten Funktionsverlust der p.Val106Ala-Pah auch zu einem sekundären BH4-Mangel, der zu einer weiteren Verminderung der Enzymaktivität beitragen könnte. Die Gabe von pharmakologischen Dosen von BH4 könnte neben der Korrektur der Proteinfehlfaltung als pharmakologisches Chaperon somit auch einen Ausgleich des sekundären intrazellulären BH4-Mangels bewirken. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen der Krankheitsentstehung und der pharmakologischen Korrektur bei den BH4-sensitiven Mausmodellen Pahenu1/enu1 und Pahenu1/enu2 kann dazu beitragen, die pharmakologische Therapie, zum Beispiel durch die Entwicklung von optimierten oder neuen Wirkstoffen, zu verbessern und effizienter zu machen. Darüber hinaus können diese Mausmodelle auch genutzt werden, um grundsätzliche Fragestellungen zu Proteinfehlfaltungserkrankungen und Degradationsmechanismen zu adressieren. So könnten die Mausmodelle bei Untersuchungen der zellulären Degradationsmaschinerie, des Einflusses von oxidativem Stress auf Proteinfaltung und der Korrektur der gestörten Proteinhomöostase mittels Proteostase-Regulatoren verwendet werden.

Abstract

Phenylketonuria (PKU) is an inborn error of amino acid metabolism which causes severe neurological impairment, if untreated. For most patients, a strict low-phenylalanine diet is the only treatment option. In clinical studies, it was shown that approximately one third of the patients respond to supplementation with pharmacological dosages of tetrahydrobiopterin (BH4), which is the natural cofactor of the enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH). Treatment with BH4 gave rise to a pharmacological therapeutic alternative that allows patients to relax their diet and tolerate more natural protein (Muntau et al. 2002). The main topic of this thesis was the identification and the detailed characterization of a BH4-responsive mouse model. The homozygous Pahenu1/enu1 mouse carries the allelic variant p.Val106Ala of murine Pah. The amino acid side chain replacement affects the regulatory domain leading to a mild PKU phenotype. The homozygous Pahenu2/enu2 mouse carries the allelic variant p.Phe263Ser, which maps to the catalytic domain of the enzyme and causes a clinical picture of severe PKU. The compound heterozygous Pahenu1/enu2 mouse shows an intermediate clinical phenotype. The amino acids Phe 263 and Val 106 of the PAH protein are conserved between humans and mice. According to phenotypes observed in mice, p.Val106Ala leads to a mild phenotype in humans and p.Phe263Ser induces classical PKU. Enzyme kinetics analyses using recombinantly expressed protein (wild-type, p.Val106Ala, p.Phe263Ser) showed good comparability between human and murine PAH. The differences between the activity of human and murine PAH in the liver tissues seemed to be due to different intrahepatic PAH amounts. The data presented here shows that murine Pah is an appropriate model for the human phenylalanine hydroxylating system. Both Pahenu1/enu1 and Pahenu1/enu2 showed BH4 responsiveness and benefit from treatment with BH4, whereas Pahenu2/enu2 showed no response to BH4 treatment. In vitro, the recombinantly expressed p.Val106Ala protein showed neither a reduction of affinity to its cofactor BH4 nor a marked reduction in specific enzyme activity. Thus, BH4 responsiveness cannot be explained by a direct cofactor effect on the enzymatic reaction. Detailed biophysical and biochemical investigation using purified protein and eukaryotically expressed protein showed propensity towards degradation and aggregation for p.Val106Ala, leading to a decrease in the available amount of functional protein. On a molecular level, BH4 rescued protein misfolding of p.Val106Ala, acting as a pharmacological chaperone. BH4 enhanced the amount of correctly folded and enzymatically active Pah. Comparison of pharmacokinetics and pharmacodynamics of BH4 therapy in Pahenu1/enu1 and Pahenu1/enu2 showed differences between genotypes. The BH4 effect is not only determined by one allele, e.g. a BH4- responsive variant (here p.Val106Ala), but also by the second allele (p.Val106Ala or null mutation p.Phe263Ser). These differences in response to the BH4 therapy may lead to the need for expanded testing in compound heterozygous patients. In ex vivo analyses, we observed differences in hepatic free intracellular BH4 between untreated genotypes. Interestingly, this was not congruent with the BH4 pattern in blood. The BH4 concentration in hepatocytes was decreased for Pahenu1/enu1 and Pahenu1/enu2 in comparison to the wild- type and Pahenu2/enu2. No differences were found in the expression of Gch1, the key enzyme of tetrahydrobiopterin biosynthesis. Moreover, no increase in the consumption of BH4 due to enzymatic uncoupling was observed for genotypes carrying the Pahenu1 allele. We demonstrated in vitro that the total amount of BH4 was not altered, but a shift in BH4 pools led to a decrease in free BH4. Misfolded p.Val106Ala Pah protein trapped BH4 making it unavailable for the enzymatic reaction. In addition to the loss of function due to the mutation p.Val106Ala, this mechanism may lead to secondary intracellular BH4 deficiency, which induces a further decrease in enzyme function. Therefore, therapeutic BH4 may not only exert a pharmacological chaperone effect on the misfolded p.Val106Ala protein, the treatment may also correct intrahepatic secondary BH4 deficiency. A better understanding of the molecular mechanisms of BH4-responsive PKU could lead to optimization of the current therapy with BH4 and might enable the identification of new and more efficient pharmacological compounds. Moreover, mice carrying the Pahenu1 allele could be used to address more general questions regarding diseases with protein misfolding and degradation. For example, the mouse model could help to elucidate mechanisms of intracellular protein degradation, the impact of oxidative stress on protein misfolding and therapeutic routes to correct protein homeostasis by proteostasis regulation.