Spektroskopische Quantifizierung von Molekülen des humanen Häm-Metabolismus

Lang, Alexander (2019): Spektroskopische Quantifizierung von Molekülen des humanen Häm-Metabolismus. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

The present dissertation covers the development of spectroscopic methods for quantitative detection of heme synthesis and heme metabolization molecules, in particular porphobilinogen, uroporphyrin I and III, coproporphyrin I and III, hemoglobin and bilirubin. The first three substances are highly specific biomarkers for the diagnosis of acute porphyria, the other two for the diagnosis of hemoglobinemia. New diagnostic tests were developed for both clinical pictures. In the heme biosynthesis, 5-aminolevulinic acid is metabolized via porphobilinogen and porphyrinogens to protoporphyrin IX, which then forms the heme complex with divalent iron (Fe2+). The steps of the heme synthesis are enzymatically catalyzed. If one of the enzymes is inhibited in its activity by a genetic disorder, the resulting condition is called porphyria. Precursors to heme such as porphyrinogens, porphyrins and porphobilinogen then accumulate in the body and are excreted with the urine. The detection of elevated levels of porphyrins and porphobilinogen in urine allows for the diagnosis of acute porphyria with very high specificity, but so far there is no rapid test for both substances. Since acute porphyria is a very rare disease and shows very unspecific but life-threatening symptoms, patients with acute porphyria are often unrecognized and undiagnosed. A suitable screening test could prevent this. To develop a rapid test for porphyrins and porphobilinogen, a device set-up was designed and constructed allowing for spectroscopic measurements of absorption and fluorescence on urine samples. An additional heating coil integrated into the device enables controlled and rapid heating of samples and thus the condensation of porphobilinogen to uroporphyrin I and porphobilin, which can be detected by either fluorescence or absorption spectroscopy. Using this setup, three new methods have been developed that can be combined to form an innovative rapid test for acute porphyria. It enables, first, the controlled photo-oxidation of porphyrinogens to porphyrins, second, the quantification of total porphyrins in urine in the concentration range between 0.2 and 20 μmol/L by a spectral fitting algorithm on the second derivative of spectra of patient samples and third, the indirect quantitative detection of porphobilinogen by the quantification of both or either uroporphyrin I or porphobilin. The developed test allows for the execution of all three methods including sample preparation in less than 15 minutes. The aim of the second spectroscopic method of this dissertation thesis was the quantification of free hemoglobin in blood plasma, which results from strong intravascular hemolysis. Bilirubin, a substance occurring in the metabolism of heme, is elevated in the blood plasma following severe hemolysis. Bilirubin prevents the quantification of free hemoglobin even at very low concentrations when employing the standard optical method for free hemoglobin quantification. A mathematical fit algorithm using the second derivative of plasma absorption spectra was developed and applied on 492 samples. It allows for the quantification of both free hemoglobin and bilirubin in blood plasma, and was therefore named “HEBI-Fit”. The publication also includes the algorithm as a Microsoft Excel file to enable other laboratories to easily implement the innovative method in their daily routine.

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden spektroskopische Methoden zum quantitativen Nachweis von Molekülen der Häm-Biosynthese und der Häm- Metabolisierung entwickelt, im Speziellen Porphobilinogen, Uroporphyrin I und III, Koproporphyrin I und III, Hämoglobin und Bilirubin. Die ersten drei Stoffe stellen sehr spezifische Biomarker für die Diagnose von akuter Porphyrie dar, die Anderen für die Diagnose von Hämoglobinämie. Für beide Krankheitsbilder wurden neue diagnostische Tests entwickelt. In der Hämsynthese wird über mehrere metabolische Schritte von 5-Aminolävulinsäure ausgehend Porphobilinogen und daraus über Porphyrinogene Protoporphyrin IX erzeugt, das den Häm- Komplex mit zweiwertigem Eisen (Fe2+) bildet. Die Schritte der Hämsynthese sind enzymatisch katalysiert. Falls durch eine genetische Störung eines der Enzyme in seiner Aktivität gehemmt ist, spricht man von Porphyrie. Vorläuferstoffe zu Häm wie Porphyrinogene, Porphyrine und Porphobilinogen reichern sich dann im Körper an und werden unter anderem mit dem Urin ausgeschieden. Der Nachweis von erhöhten Konzentrationen von Porphyrinen und Porphobilinogen in Urin erlaubt mit sehr hoher Spezifität die Diagnose von akuter Porphyrie, es existiert jedoch kein Schnelltest für beide Substanzen. Da akute Porphyrie eine sehr seltene Erkrankung ist und sehr unspezifische, allerdings lebensbedrohliche Symptome zeigt, wird akute Porphyrie häufig nicht erkannt und Patienten fehldiagnostiziert. Ein geeigneter Schnelltest könnte das verhindern. Zur Entwicklung eines Schnelltests für Porphyrine und Porphobilinogen wurde ein Messaufbau konstruiert, der spektroskopische Messungen der Absorption und Fluoreszenz an Urinproben ermöglicht. Ein zusätzlich in das Gerät integriertes Thermoelement erlaubt kontrolliertes und schnelles Erhitzen von Proben und damit die Kondensation von optisch nicht nachweisbarem Porphobilinogen zu Uroporphyrin I und Porphobilin, welche über Fluoreszenzbeziehungsweise Absorptionsspektroskopie nachgewiesen werden können. Es wurden mithilfe dieses Aufbaus drei Methoden entwickelt, die zu einem neuen Schnelltest für akute Porphyrie kombiniert werden können. Dieser erlaubt erstens die kontrollierte Foto-Oxidation von Porphyrinogenen zu Porphyrinen, zweitens die Quantifizierung der Gesamtporphyrine in Urin im Konzentrationsbereich zwischen 0,2 und 20 μmol/L durch ein mathematisches Näherungs- Verfahren an der zweiten Ableitung der Spektren von Patientenproben und drittens den indirekten, quantitativen Nachweis von Porphobilinogen durch die Quantifizierung von Uroporphyrin I oder Porphobilin. Das entwickelte Messverfahren ermöglicht die Durchführung aller drei Messungen inklusive Probenvorbereitung in weniger als 15 Minuten. Ziel der anderen spektroskopischen Methode dieser Promotionsarbeit war die Quantifizierung von freiem Hämoglobin in Blutplasma, welches durch starke intravaskuläre Hämolyse entsteht. Bilirubin, ein Stoff der bei der Metabolisierung von Häm auftritt, findet sich bei schwerer Hämolyse vermehrt im Blutplasma. Bilirubin verhindert bereits in sehr geringen Konzentrationen die Quantifizierung von freiem Hämoglobin bei Messungen mit der Standardmethode. Es wurde an 492 Proben ein mathematischer Näherungs-Algorithmus („HEBI-Fit“ genannt) an der zweiten Ableitung der Plasmaabsorptionsspektren entwickelt, welcher die Quantifizierung von freiem Hämoglobin und von Bilirubin ermöglicht. Der entsprechenden Publikation wurde dieser Auswerte- Algorithmus als Microsoft Excel File angehängt, um es anderen Laboren zu ermöglichen, diese innovative Methode selbst einfach in ihre Labor-Auswertungen zu implementieren.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 18. März 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Sroka, Ronald