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Der Surfactant-Lipidtransporter ABCA3 wird in LAMP3-positiven Vesikeln N-terminal proteolytisch gespalten
Der Surfactant-Lipidtransporter ABCA3 wird in LAMP3-positiven Vesikeln N-terminal proteolytisch gespalten
Der ATP-binding cassette transporter A3 (ABCA3) ist ein Phospholipidtransporter, welcher in den Typ II Pneumozyten der Lunge exprimiert wird und an der Ausbildung eines funktionstüchtigen Surfactantfilms beteiligt ist. Mutationen im ABCA3-Gen können sowohl zur Entstehung des neonatalen Atemnotsyndroms, als auch zur Entwicklung einer interstitiellen Lungenerkrankung führen. Das ABCA3-WT-Protein wird im Endoplasmatischem Reticulum gefaltet und anschließend im Golgi-Apparat glykosyliert, bevor es seinen Wirkort, die Lamellarkörperchen (LBs), über deren Zwischenstufe, die Multivesikularkörperchen (MVBs), erreicht. Über die weiteren Schritte der WT-Prozessierung von ABCA3 war bisher wenig bekannt. Da C-terminal mit HA markiertes WT-ABCA3 im Western Blot in Form von zwei Banden mit einer Größe von 190kDa bzw. 150kDa zur Darstellung kommt, wurde die Hypothese aufgestellt, dass die kleinere Form von ABCA3 im Lauf der Prozessierung aus der größeren Form hervorgeht. Mithilfe eines zuvor durch Klonierung erstellten N-terminal markierten WT-ABCA3-Vektors (GFPN-ABCA3-WT-Vektor) konnte in Western Blots gezeigt werden, dass der 150kDa-Form von WT-ABCA3 der N-Terminus fehlt. In weiteren Versuchen konnte mittels schrittweiser Unterbrechung der WT-Protein-Prozessierung durch unterschiedliche Antibiotika und anschließend erneuter Auswertung der Ergebnisse mittels Western Blot dargelegt werden, dass die proteolytische Prozessierung innerhalb der LBs abläuft. Diese Ergebnisse konnten durch Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigt werden. Als verantwortliche Enzyme hierfür wurden Cysteinproteasen ermittelt. Da einige ABCA3-Mutationen zu einer gestörten Proteinprozessierung führen, können die gewonnenen Daten und das somit bessere Verständnis der WT-Prozessierung in Zukunft möglicherweise genutzt werden, um neue Therapieansätze zur Behandlung der genetischen Form des neonatalen Atemnnotsyndroms und der ILD zu entwickeln.
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Gschwendtner, Stefanie
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Gschwendtner, Stefanie (2018): Der Surfactant-Lipidtransporter ABCA3 wird in LAMP3-positiven Vesikeln N-terminal proteolytisch gespalten. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Der ATP-binding cassette transporter A3 (ABCA3) ist ein Phospholipidtransporter, welcher in den Typ II Pneumozyten der Lunge exprimiert wird und an der Ausbildung eines funktionstüchtigen Surfactantfilms beteiligt ist. Mutationen im ABCA3-Gen können sowohl zur Entstehung des neonatalen Atemnotsyndroms, als auch zur Entwicklung einer interstitiellen Lungenerkrankung führen. Das ABCA3-WT-Protein wird im Endoplasmatischem Reticulum gefaltet und anschließend im Golgi-Apparat glykosyliert, bevor es seinen Wirkort, die Lamellarkörperchen (LBs), über deren Zwischenstufe, die Multivesikularkörperchen (MVBs), erreicht. Über die weiteren Schritte der WT-Prozessierung von ABCA3 war bisher wenig bekannt. Da C-terminal mit HA markiertes WT-ABCA3 im Western Blot in Form von zwei Banden mit einer Größe von 190kDa bzw. 150kDa zur Darstellung kommt, wurde die Hypothese aufgestellt, dass die kleinere Form von ABCA3 im Lauf der Prozessierung aus der größeren Form hervorgeht. Mithilfe eines zuvor durch Klonierung erstellten N-terminal markierten WT-ABCA3-Vektors (GFPN-ABCA3-WT-Vektor) konnte in Western Blots gezeigt werden, dass der 150kDa-Form von WT-ABCA3 der N-Terminus fehlt. In weiteren Versuchen konnte mittels schrittweiser Unterbrechung der WT-Protein-Prozessierung durch unterschiedliche Antibiotika und anschließend erneuter Auswertung der Ergebnisse mittels Western Blot dargelegt werden, dass die proteolytische Prozessierung innerhalb der LBs abläuft. Diese Ergebnisse konnten durch Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigt werden. Als verantwortliche Enzyme hierfür wurden Cysteinproteasen ermittelt. Da einige ABCA3-Mutationen zu einer gestörten Proteinprozessierung führen, können die gewonnenen Daten und das somit bessere Verständnis der WT-Prozessierung in Zukunft möglicherweise genutzt werden, um neue Therapieansätze zur Behandlung der genetischen Form des neonatalen Atemnnotsyndroms und der ILD zu entwickeln.