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Epigenetische Regulation von Retrotransposons in Säugetierzellen
Epigenetische Regulation von Retrotransposons in Säugetierzellen
Große Teile sowohl des menschlichen als auch des Mausgenoms sind abgeleitet von Retrotransposons [1–3]. Es wird angenommen, dass diese Elemente ihren Ursprung in evolutionär lange zurückliegenden Infektionen mit exogenen Retroviren haben [4, 5]. Einige von ihnen haben auch nach Millionen von Jahren in ihrem Wirtsgenom die Fähigkeit zur Retrotransposition nicht verloren [6–9]. Unter Retrotransposition versteht man eine Vervielfältigung des betreffenden Retroelementes über eine RNA-Zwischenstufe und seine erneute Integration als DNA an einer anderen Stelle des Genoms [10]. Durch solche Vorgänge kann die Expression umgebender Gene verstärkt, gehemmt oder sogar das Gen komplett zerstört werden. In der Literatur sind zahlreiche Retrotranspositionsvorgänge beim Menschen beschrieben, von denen bekannt ist, dass sie Erkrankungen verursacht haben [11]. Doch auch ohne vollständige Retrotransposition können fehlregulierte Retrotransposons die Genexpressionsmuster von Zellen wesentlich beeinträchtigen und damit unter anderem zur Entstehung von Krebserkrankungen beitragen [12]. Ein Beispiel für immer noch aktive Retrotransposons im Mausgenom sind die IAP-Elemente (intracisternal A-type particles, eine Unterfamilie der LTR-Retrotransposons), deren Expression bereits während der frühen Embryogenese durch epigenetische Mechanismen unterdrückt wird [13–15]. In dieser Doktorarbeit wurde eine Teilsequenz aus den IAP-Elementen identifiziert, welche spezifisch für embryonale Stammzellen der Maus die Bildung von Heterochromatin veranlassen kann, wenn sie neu ins Genom der Zellen integriert wird: Diese Sequenz wurde mit "GAG 2.22" benannt [16]. Das GAG 2.22-Element ist in der Lage, die Abschaltung benachbarter aktiver Gene in Mausstammzellen zu vermitteln. Um dies zu zeigen, wurde ein Reporter-System verwendet, bei dem das Sequenzelement ein benachbartes Gen ausschaltet, welches ein grün fluoreszierendes Protein (EGFP) kodiert [17]. Weiterhin wurden punktmutierte Varianten dieser Repressionssequenz generiert, bei denen die Stilllegung des benachbarten Gens nahezu vollständig verloren geht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Rekrutierung von Heterochromatin an GAG 2.22 um einen sequenzspezifischen Mechanismus handelt. Als elementare Faktoren in diesem Mechanismus konnten das Korepressorprotein Kap1 und die Histonmethyltransferase Setdb1 identifiziert werden, indem für diese und andere Heterochromatin-Faktoren defiziente Zelllinien untersucht wurden. Für Kap1 und Setdb1 war bereits beschrieben, dass sie an der Unterdrückung der Expression von endogenen IAP-Retrotransposons in embryonalen Stammzellen der Maus beteiligt sind [18, 19]. Darüber hinaus konnte die SNF2-Typ ATPase Atrx als weiterer wichtiger Faktor für GAG 2.22-abhängiges Silencing des EGFP-Reporters identifiziert werden [16]. In Atrx-defizienten Zellen zeigte sich der Silencing-Prozess stark verzögert, die grundsätzliche Fähigkeit zum Silencing war jedoch erhalten. Wurde allerdings das Heterochromatin der Zellen durch verminderte Expression von Kap1 oder Setdb1 beeinträchtigt, so reagierten Atrx-Knockout-Zellen mit einer deutlich stärkeren Derepression des Reporters. Auch für endogene IAP-Elemente konnte nachgewiesen werden, dass alleiniger Verlust von Atrx keinen Einfluss auf das Ausmaß ihrer Expression hat. Bei zusätzlicher Reduktion des Kap1-Levels in den Zellen kam es jedoch zu einer signifikanten Hochregulation der IAP-Transkripte. Die Kernpunkte dieser Arbeit sind die Identifikation eines neuen Sequenzelementes aus IAP-Retrotransposons (GAG 2.22), das in der Lage ist, in einem sequenzspezifischen Mechanismus repressives Chromatin zu rekrutieren, sowie die Untersuchung der Rolle verschiedener Heterochromatin-Faktoren in diesem Prozess. Im Gegensatz zu den Faktoren Kap1 und Setdb1 erwies sich Atrx als nicht zwingend erforderlich für GAG 2.22-abhängiges Silencing. Für Atrx zeigte sich vielmehr ein beschleunigender und stabilisierender Effekt auf das entstehende Heterochromatin.
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Schmidt, Katharina
2019
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Schmidt, Katharina (2019): Epigenetische Regulation von Retrotransposons in Säugetierzellen. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Große Teile sowohl des menschlichen als auch des Mausgenoms sind abgeleitet von Retrotransposons [1–3]. Es wird angenommen, dass diese Elemente ihren Ursprung in evolutionär lange zurückliegenden Infektionen mit exogenen Retroviren haben [4, 5]. Einige von ihnen haben auch nach Millionen von Jahren in ihrem Wirtsgenom die Fähigkeit zur Retrotransposition nicht verloren [6–9]. Unter Retrotransposition versteht man eine Vervielfältigung des betreffenden Retroelementes über eine RNA-Zwischenstufe und seine erneute Integration als DNA an einer anderen Stelle des Genoms [10]. Durch solche Vorgänge kann die Expression umgebender Gene verstärkt, gehemmt oder sogar das Gen komplett zerstört werden. In der Literatur sind zahlreiche Retrotranspositionsvorgänge beim Menschen beschrieben, von denen bekannt ist, dass sie Erkrankungen verursacht haben [11]. Doch auch ohne vollständige Retrotransposition können fehlregulierte Retrotransposons die Genexpressionsmuster von Zellen wesentlich beeinträchtigen und damit unter anderem zur Entstehung von Krebserkrankungen beitragen [12]. Ein Beispiel für immer noch aktive Retrotransposons im Mausgenom sind die IAP-Elemente (intracisternal A-type particles, eine Unterfamilie der LTR-Retrotransposons), deren Expression bereits während der frühen Embryogenese durch epigenetische Mechanismen unterdrückt wird [13–15]. In dieser Doktorarbeit wurde eine Teilsequenz aus den IAP-Elementen identifiziert, welche spezifisch für embryonale Stammzellen der Maus die Bildung von Heterochromatin veranlassen kann, wenn sie neu ins Genom der Zellen integriert wird: Diese Sequenz wurde mit "GAG 2.22" benannt [16]. Das GAG 2.22-Element ist in der Lage, die Abschaltung benachbarter aktiver Gene in Mausstammzellen zu vermitteln. Um dies zu zeigen, wurde ein Reporter-System verwendet, bei dem das Sequenzelement ein benachbartes Gen ausschaltet, welches ein grün fluoreszierendes Protein (EGFP) kodiert [17]. Weiterhin wurden punktmutierte Varianten dieser Repressionssequenz generiert, bei denen die Stilllegung des benachbarten Gens nahezu vollständig verloren geht. Dadurch konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Rekrutierung von Heterochromatin an GAG 2.22 um einen sequenzspezifischen Mechanismus handelt. Als elementare Faktoren in diesem Mechanismus konnten das Korepressorprotein Kap1 und die Histonmethyltransferase Setdb1 identifiziert werden, indem für diese und andere Heterochromatin-Faktoren defiziente Zelllinien untersucht wurden. Für Kap1 und Setdb1 war bereits beschrieben, dass sie an der Unterdrückung der Expression von endogenen IAP-Retrotransposons in embryonalen Stammzellen der Maus beteiligt sind [18, 19]. Darüber hinaus konnte die SNF2-Typ ATPase Atrx als weiterer wichtiger Faktor für GAG 2.22-abhängiges Silencing des EGFP-Reporters identifiziert werden [16]. In Atrx-defizienten Zellen zeigte sich der Silencing-Prozess stark verzögert, die grundsätzliche Fähigkeit zum Silencing war jedoch erhalten. Wurde allerdings das Heterochromatin der Zellen durch verminderte Expression von Kap1 oder Setdb1 beeinträchtigt, so reagierten Atrx-Knockout-Zellen mit einer deutlich stärkeren Derepression des Reporters. Auch für endogene IAP-Elemente konnte nachgewiesen werden, dass alleiniger Verlust von Atrx keinen Einfluss auf das Ausmaß ihrer Expression hat. Bei zusätzlicher Reduktion des Kap1-Levels in den Zellen kam es jedoch zu einer signifikanten Hochregulation der IAP-Transkripte. Die Kernpunkte dieser Arbeit sind die Identifikation eines neuen Sequenzelementes aus IAP-Retrotransposons (GAG 2.22), das in der Lage ist, in einem sequenzspezifischen Mechanismus repressives Chromatin zu rekrutieren, sowie die Untersuchung der Rolle verschiedener Heterochromatin-Faktoren in diesem Prozess. Im Gegensatz zu den Faktoren Kap1 und Setdb1 erwies sich Atrx als nicht zwingend erforderlich für GAG 2.22-abhängiges Silencing. Für Atrx zeigte sich vielmehr ein beschleunigender und stabilisierender Effekt auf das entstehende Heterochromatin.