Pharmakologische Beeinflussbarkeit der TRPM7 Kanalkinase

Schäfer, Sebastian (2019): Pharmakologische Beeinflussbarkeit der TRPM7 Kanalkinase. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

TRPM7 ist ein bifunktionales Protein, dass eine TRP-Ionenkanal Domäne, gekoppelt an eine α-Kinasedomäne, aufweist. TRPM7 ist essentiell für Zellproliferation und -wachstum. Die Hochregulierung der TRPM7-Funktion ist beteiligt an anoxischem neuronalem Zelltod, kardialer Fibrose und Tumorzellproliferation/-invasion. Zum Zeitpunkt des Projektbeginns sind wenige nichtselektive Inhibitoren der Proteinfunktion und keine Positivmodulatoren bekannt. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand in der Identifizierung weiterer Antagonisten sowie der ersten Agonisten der TRPM7-Kanalfunktion. Identifizierte Wirkstoffe wurden zudem im Zellmodell auf ihre Eigenschaft untersucht, Einfluss auf TRPM7-abhängige Prozesse zu nehmen. Wir führten einen bioluminiszenzbasierten Hochdurchsatzscreen zur Identifizierung von TRPM7-Modulatoren durch. In einem Primärscreen konnten 20 potentielle Aktivatoren und sechs Inhibitoren identifiziert werden. Der TRPM7-Blocker NS8593 sowie die Aktivatoren Naltriben und Mibefradil wurden für weiterführende Versuche selektiert. Wir verwendeten Ca2+-Imaging-Versuche sowie die PatchClamp-Technik, um den funktionellen Einfluss der Modulatoren auf TRPM7-vermittelte Ionenströme zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass NS8593 ein potenter Blocker TRPM7-vermittelter Ströme ist. Die Blockade der Kanalfunktion ist schnell und reversibel. Weitere TRP-Proteine werden nicht durch NS8593 beeinflusst. In zellbiologischen Versuchen wurde die Zellmotilität von HEK293 Zellen durch NS8593 inhibiert. Dieser Effekt gleicht der zuvor beschriebenen Auswirkung eines TRPM7 know-downs im Zellmodell. Naltriben ist ein potenter positiver Modulator der TRPM7-Kanalfunktion. Die Aktivierung erfolgt unabhängig von der intrazellulären Magnesiumkonzentration, ist reversibel und, im Vergleich zu weiteren TRP-Proteinen, spezifisch für TRPM7. Mibefradil übt ebenfalls einen stimulierenden Effekt auf die TRPM7-Funktion aus. Im Gegensatz zu Naltriben ist dieser Effekt stark abhängig von der zytoplasmatischen Magnesiumkonzentration. Es ist uns gelungen, strukturell unabhängige Leitwirkstoffe zu identifizieren, die als Modulatoren der TRPM7-Kanalfunktion fungieren. Die Verbindungen erwiesen sich als sehr geeignet zur Untersuchung der funktionalen Charakeristika der TRPM7-Ströme sowie durch TRPM7 regulierter zellulärer Prozesse. Unsere Ergebnisse bieten ein neues pharmakologisches Werkzeug zur Untersuchung der TRPM7-Funktion in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. Weiterhin wird ein Weg zur Erforschung neuer, hoch-spezifischer TRPM7-Modulatoren aufgezeigt

Abstract

TRPM7 is a bifunctional Protein comprising a TRP ion channel domain, fused to a α-kinase domain. TRPM7 is essential for cell proliferation and cell growth. The up-regulation of TRPM7 function is involved in anoxic neuronal cell death, cardiac fibrosis and tumor cell proliferation as well as cell invasion. At the time when this project was initiated, only a few highly nonselective inhibitors of the TRPM7 channel have been described, and no positive modulators of TRPM7 have been reported. The main aim of this work was to identify new drug-like inhibitors and first activators of the TRPM7 channel. In addition, we studied whether these molecules enable to regulate TRPM7-dependent processes in cultured cells. Using a bioluminescence-based Ca2+ imaging, we performed a screen for new modulators of the TRPM7 channel. We isolated 20 activators and 6 inhibitors of the TRPM7 channel. The channel blocker, NS8593, as well as two activators, naltriben and mibefradil, were selected for a follow-up characterization. We used Ca2+ imaging and the patch-clamp techniques to investigate the functional impact of these molecules on TRPM7 currents. We found that NS8593 is a potent blocker of TRPM7 currents. The inhibitory effect of NS8593 on TRPM7 was fast and reversible. NS8593 did not affect activity of several other TRP channels examined. Application of NS8593 resulted in suppressed motility of HEK293 cells resembling the well-described effect of genetic knock-down of TRPM7. Naltriben was found to be a potent positive modulator of the TRPM7 channel. Naltriben-induced activation of TRPM7 currents was rapid, independent of cytosolic Mg2+ levels, reversible and, compared to related TRP-channels, specific for TRPM7. Mibefradil elicited stimulatory effect on the TRPM7 channel. However, compared to naltriben, the stimulatory action of mibefradil was highly dependent on cytoplasmic Mg2+ levels. Taken together, we identified several structurally-unrelated lead compounds acting as inhibitors and activators of the TRPM7 channel. The identified compounds were found to be well-suited to study functional characteristics of TRPM7 currents and cellular processes regulated by TRPM7. Hence, our results provide new pharmacological tools to study a role of TRPM7 in physiological and pathophysiological processes and suggest a path to the discovery of new highly selective TRPM7 modulators.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: TRPM7
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 21. Februar 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Gudermann, Thomas