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Functional genomics in symbiotic interactions. from high-throughput sequencing to functional characterization
Functional genomics in symbiotic interactions. from high-throughput sequencing to functional characterization
Functional genomics provide information beyond simple genotype-phenotype relationships. Whole genome and transcriptome sequencing is used to compare existing results to sequencing data from newly sequenced species and to thereby infer functions. With this approach, also analysis of organisms that are difficult to culture, or for which no transformation methods are available, is feasible. This applies e.g. to the Glomeromycota fungi, which are obligate symbionts and their hyphae contain thousands of nuclei in a common cytoplasm. The work presented here shows the different stages of functional genomics in three parts. In the first part, a complete and gap-less assembly of the bacterial genome of Rhizobium leguminosarum Norway was created by using different 2nd and 3rd generation sequencing techniques. This assembly shows the advantages of using short read assemblies in combination with long reads. This is particularly relevant to bridge for example long repeat regions and retain base accuracy, which is also applicable for larger genomes. In the second part, the assembly and analysis of the transcriptome of the early diverging glomeromycotan fungus Geosiphon pyriformis was performed. The results of functional annotation of the non-redundant virtual transcripts show higher similarity to Asco-, Basidio-, and Zygomycota than to Glomeromycota. This indicates that the different symbiotic life-style of G. pyriformis, compared to other Glomeromycota, also demands a different setup of expressed genes. On the other hand, the absence of the “Missing Glomeromycota Core Genes” set in this transcriptome suggests that there was a common obligate symbiotic ancestor, depending on either cyanobacteria or algae. In the course of this analysis three transcripts were identified that show similarities to genes encoding amyloid proteins and pose promising candidates for functional characterization. The third part regards the functional characterization of effector candidate genes that had been identified in Rhizophagus irregularis through a genome comparison approach. Using host induced gene silencing one effector candidate gene was downregulated and showed a strong phenotype in colonization and arbuscules. Further analyses indicate that the protein encoded by this gene is involved in trehalose biosynthesis and is not an effector. The phenotype of downregulation shows that trehalose biosynthesis plays an important role in the establishment or maintenance of a functional symbiosis. In conclusion, this work demonstrates the possibilities of functional genomics: creating and analyzing complete gap-less genomes, using the acquired data to find candidate genes for specific functions, and functionally characterizing newly identified genes in vitro., Das Feld “Functional Genomics” ermöglicht Einblicke über einfache Genotyp-Phänotyp-Beziehungen hinaus. Die vollständige Genom- und Transkriptom-Sequenzierung wird verwendet, um bestehende Ergebnisse mit Sequenzierungsdaten von neu sequenzierten Arten zu vergleichen und damit auf Funktionen zu schließen. Mit diesem Ansatz ist auch eine Analyse von Organismen möglich, die schwierig zu kultivieren sind oder für die keine Transformationsmethoden verfügbar sind. Dies gilt z.B. für Glomeromycota-Pilze, welche obligate Symbionten sind und in deren Hyphen Tausende von Kernen in einem gemeinsamen Zytoplasma enthalten sind. Die hier vorgestellte Arbeit zeigt die verschiedenen Stadien der funktionellen Genomik in drei Teilen. Im ersten Teil wurde ein vollständiges und lückenloses Bakteriengenom von Rhizobium leguminosarum Norway mit verschiedenen Sequenzierungstechniken der 2. und 3. Generation erstellt. Dieses Assembly zeigt welche Vorteile die Verwendung einer Kombination aus kurzen und langen Sequenzier-Reads mit sich bringt, wie zum Beispiel die Möglichkeit lange “repeat regions” zu überbrücken, so dass sich diese Kombination auch gut auf größere Genome anwenden lässt. Im zweiten Teil wurde das Transkriptom des früh divergierenden Glomeromycota-Pilzes Geosiphon pyriformis assembliert und analysiert. Die Ergebnisse der funktionellen Annotation der “non-redundant virtual transcripts” zeigen eine höhere Ähnlichkeit zu Asco-, Basidio- und Zygomycota als zu Glomeromycota. Dies deutet darauf hin, dass der unterschiedliche symbiotische Lebensstil von G. pyriformis im Vergleich zu anderen Glomeromycota auch ein verändertes Genexpressionsprofil erfordert. Andererseits legt die Abwesenheit der "Missing Glomeromycota Core Genes" in diesem Transkriptom nahe, dass es einen gemeinsamen obligat symbiotischen Vorfahren gab, abhängig entweder von Cyanobakterien oder Algen. Im Zuge dieser Analyse wurden drei Transkripte identifiziert, die strukturell Ähnlichkeiten zu Genen aufweisen, welche für Amyloidproteinen kodieren, und vielversprechende Kandidaten für die funktionelle Charakterisierung darstellen. Der dritte Teil befasst sich mit der funktionellen Charakterisierung von Effektorkandidaten, die in Rhizophagus irregularis durch einen Genomvergleich identifiziert wurden. Unter Verwendung von "Host Induced Gene Silencing" wurde ein Kandidatengen herunterreguliert und zeigte in der Folge einen starken Phänotyp in Kolonisierung und der Form und Größe der Arbuskeln. Weitere Analysen zeigen, dass das von diesem Gen kodierte Protein an der Trehalose-Biosynthese beteiligt ist und kein Effektor ist. Der Phänotyp der Herunterregulation zeigt, dass die Trehalose-Biosynthese eine wichtige Rolle bei der Bildung oder Aufrechterhaltung einer funktionellen Symbiose spielt. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die umfangreichen Möglichkeiten von “functional genomics” auf: Erstellung und Analyse vollständiger lückenloser Genome, Verwendung der gewonnenen Daten, um Kandidatengene für spezifische Funktionen zu finden, und funktionelle Charakterisierung dieser so identifizierten Gene in vitro.
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Hoffrichter, Anne
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Hoffrichter, Anne (2018): Functional genomics in symbiotic interactions: from high-throughput sequencing to functional characterization. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Functional genomics provide information beyond simple genotype-phenotype relationships. Whole genome and transcriptome sequencing is used to compare existing results to sequencing data from newly sequenced species and to thereby infer functions. With this approach, also analysis of organisms that are difficult to culture, or for which no transformation methods are available, is feasible. This applies e.g. to the Glomeromycota fungi, which are obligate symbionts and their hyphae contain thousands of nuclei in a common cytoplasm. The work presented here shows the different stages of functional genomics in three parts. In the first part, a complete and gap-less assembly of the bacterial genome of Rhizobium leguminosarum Norway was created by using different 2nd and 3rd generation sequencing techniques. This assembly shows the advantages of using short read assemblies in combination with long reads. This is particularly relevant to bridge for example long repeat regions and retain base accuracy, which is also applicable for larger genomes. In the second part, the assembly and analysis of the transcriptome of the early diverging glomeromycotan fungus Geosiphon pyriformis was performed. The results of functional annotation of the non-redundant virtual transcripts show higher similarity to Asco-, Basidio-, and Zygomycota than to Glomeromycota. This indicates that the different symbiotic life-style of G. pyriformis, compared to other Glomeromycota, also demands a different setup of expressed genes. On the other hand, the absence of the “Missing Glomeromycota Core Genes” set in this transcriptome suggests that there was a common obligate symbiotic ancestor, depending on either cyanobacteria or algae. In the course of this analysis three transcripts were identified that show similarities to genes encoding amyloid proteins and pose promising candidates for functional characterization. The third part regards the functional characterization of effector candidate genes that had been identified in Rhizophagus irregularis through a genome comparison approach. Using host induced gene silencing one effector candidate gene was downregulated and showed a strong phenotype in colonization and arbuscules. Further analyses indicate that the protein encoded by this gene is involved in trehalose biosynthesis and is not an effector. The phenotype of downregulation shows that trehalose biosynthesis plays an important role in the establishment or maintenance of a functional symbiosis. In conclusion, this work demonstrates the possibilities of functional genomics: creating and analyzing complete gap-less genomes, using the acquired data to find candidate genes for specific functions, and functionally characterizing newly identified genes in vitro.

Abstract

Das Feld “Functional Genomics” ermöglicht Einblicke über einfache Genotyp-Phänotyp-Beziehungen hinaus. Die vollständige Genom- und Transkriptom-Sequenzierung wird verwendet, um bestehende Ergebnisse mit Sequenzierungsdaten von neu sequenzierten Arten zu vergleichen und damit auf Funktionen zu schließen. Mit diesem Ansatz ist auch eine Analyse von Organismen möglich, die schwierig zu kultivieren sind oder für die keine Transformationsmethoden verfügbar sind. Dies gilt z.B. für Glomeromycota-Pilze, welche obligate Symbionten sind und in deren Hyphen Tausende von Kernen in einem gemeinsamen Zytoplasma enthalten sind. Die hier vorgestellte Arbeit zeigt die verschiedenen Stadien der funktionellen Genomik in drei Teilen. Im ersten Teil wurde ein vollständiges und lückenloses Bakteriengenom von Rhizobium leguminosarum Norway mit verschiedenen Sequenzierungstechniken der 2. und 3. Generation erstellt. Dieses Assembly zeigt welche Vorteile die Verwendung einer Kombination aus kurzen und langen Sequenzier-Reads mit sich bringt, wie zum Beispiel die Möglichkeit lange “repeat regions” zu überbrücken, so dass sich diese Kombination auch gut auf größere Genome anwenden lässt. Im zweiten Teil wurde das Transkriptom des früh divergierenden Glomeromycota-Pilzes Geosiphon pyriformis assembliert und analysiert. Die Ergebnisse der funktionellen Annotation der “non-redundant virtual transcripts” zeigen eine höhere Ähnlichkeit zu Asco-, Basidio- und Zygomycota als zu Glomeromycota. Dies deutet darauf hin, dass der unterschiedliche symbiotische Lebensstil von G. pyriformis im Vergleich zu anderen Glomeromycota auch ein verändertes Genexpressionsprofil erfordert. Andererseits legt die Abwesenheit der "Missing Glomeromycota Core Genes" in diesem Transkriptom nahe, dass es einen gemeinsamen obligat symbiotischen Vorfahren gab, abhängig entweder von Cyanobakterien oder Algen. Im Zuge dieser Analyse wurden drei Transkripte identifiziert, die strukturell Ähnlichkeiten zu Genen aufweisen, welche für Amyloidproteinen kodieren, und vielversprechende Kandidaten für die funktionelle Charakterisierung darstellen. Der dritte Teil befasst sich mit der funktionellen Charakterisierung von Effektorkandidaten, die in Rhizophagus irregularis durch einen Genomvergleich identifiziert wurden. Unter Verwendung von "Host Induced Gene Silencing" wurde ein Kandidatengen herunterreguliert und zeigte in der Folge einen starken Phänotyp in Kolonisierung und der Form und Größe der Arbuskeln. Weitere Analysen zeigen, dass das von diesem Gen kodierte Protein an der Trehalose-Biosynthese beteiligt ist und kein Effektor ist. Der Phänotyp der Herunterregulation zeigt, dass die Trehalose-Biosynthese eine wichtige Rolle bei der Bildung oder Aufrechterhaltung einer funktionellen Symbiose spielt. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die umfangreichen Möglichkeiten von “functional genomics” auf: Erstellung und Analyse vollständiger lückenloser Genome, Verwendung der gewonnenen Daten, um Kandidatengene für spezifische Funktionen zu finden, und funktionelle Charakterisierung dieser so identifizierten Gene in vitro.