Diagnostic and therapeutic applications of CA XII targeting 6A10 Fab

Fiedler, Luise (2019): Diagnostic and therapeutic applications of CA XII targeting 6A10 Fab: radiochemical and biological studies. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

The high energy demand of fast and aggressively growing tumor cells is covered by both anaer-obic and aerobic glycolysis. This results in an intracellular accumulation of mostly acidic metabol-ic products. Thus, balancing the intracellular pH is demanding for tumor cells, yet crucial for their optimal proliferation and survival. The carbonic anhydrases (CA) constitute a family of enzymes that catalyse the hydration of carbon dioxide, yielding the bicarbonate ion, which serves as the main buffer system in most organisms. CA XII is a membrane-tethered isozyme on several types of tumors and an excellent target for nuclear medicine diagnosis and therapy. The specific CA XII binding 6A10 Fab (fragment antigen binding) was shown to be of great interest as a new carrier molecule for a radioactive nuclide. A suitable radionuclide for therapeutic applications accompa-nied with single photon emission computed tomography (SPECT) imaging techniques is lutetium-177. In this study, the 177Lu-labelled 6A10 Fab was for the first time evaluated in vitro and in vivo as an agent for local intracavitary radioimmunotherapy (RIT) of glioblastomas. To extend the 6A10 Fab´s application beyond the local treatment in the brain, a systemic injection for the detec-tion of CA XII expressing tumors was investigated. For this purpose, this study evaluated the automated production of copper-64 for radiolabelling purposes to provide 64Cu-labelled 6A10 Fab for positron emission tomography (PET) studies. For therapeutic applications, the protein was conjugated with p-SCN-Bn-CHX-A´´-DTPA at a mo-lar chelator-to-protein ratio of 1:0.96 and radiolabelled with lutetium-177 with a specific activity of 1.5 GBq/mg. Radio-TLC revealed a radiochemical purity of greater than 96%. The radioconjugate was analyzed via flow cytometry, confirming the persisting CA XII binding capacity after suc-cessful modification. The radiochemical stability of the compound was determined to be greater than 90% after 72 h of incubation in human cerebrospinal fluid (37 °C), human plasma (37 °C) and labelling buffer (room temperature). A mouse xenograft model with CA XII-positive glioma cells was used for biodistribution studies, autoradiographic examinations and first in vivo imaging experiments. The tumor revealed a moderate uptake of up to 3.1 ± 0.9 %ID/g 6 h post injection (p.i.) while significantly high and long-lasting kidney retention (55.6 ± 13.0 %ID/g 48 h p.i.) was found. Tumor slices were analyzed autoradiographically and microscopically to confirm that re-gions of high activity uptake also show high cell density and vice versa. Tumors were success-fully visualized using planar scintigraphy or SPECT/CT techniques and a tumor-to-contralateral ratio of 2.4 (5 h p.i.) was measured. Copper-64 was produced using an automated setup and characterized with respect to its use as a radiolabelling nuclide. Nickel-64, which was used as target material, was electrochemically de-posited with yields of up to 96%, automatically send to a cyclotron, and irradiated with protons (2 - 5 h, 11 – 14.5 MeV, 20 - 30 µA), yielding a maximum activity of approx. 5 GBq. In addition to copper-64, irradiation by-products were quantified by gamma spectroscopy as 0.03 ± 0.10 At% 55Co, 0.004 ± 0.014 At% 57Co, and 1.4 ± 3.4 At% 61Co at the end of irradiation. Ion chromatog-raphy of the dissolved target led to a radiochemical purity of >99% in the final product fraction. The copper-64, dissolved in 9 ml HCl, was evaporated to dryness and taken up in 400 µl of 0.1 M HCl. Optimization of the module rinsing methods lead to molar activities of up to 133 GBq/µmol. The efficiency of rinsing methods was evaluated by determination of non-radioactive metal con-taminations via ICP-OES while the molar activity was calculated by titration of the copper-64 with 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid (TETA). For diagnostic purposes, the 6A10 Fab was conjugated with p-NCS-Bn-NODA-GA, radiolabelled with copper-64 and used for PET imaging and a biodistribution study in mice. First in vivo experi-ments of the 64Cu-labelled 6A10 Fab showed a high tumor uptake of up to 6.9 ± 1.6 %ID/g. PET analysis revealed a tumor-to-contralateral ratio of 11.8 ± 0.3 (n = 2) 4 h p.i.. The results of this study showed the high potential of the radiolabelled 6A10 Fab fragment for possible therapeutic and diagnostic applications. Radiolabelled with lutetium-177, the protein is suitable for the local therapeutic application in the brain since it showed a moderate tumor uptake, and a good radiochemical stability under physiological conditions. Additionally, it does not cross the blood-brain barrier (BBB). Further investigations on an orthotopic animal model to generate data closer to the final clinical application would be beneficial to estimate the compound´s distribu-tion after a local application. By radiolabelling the Fab with copper-64, high tumor uptake enabling high resolution PET images was achieved, which encourages further investigations concerning a future systemic application for diagnostic purposes. The automated production of copper-64 re-sulted in good radioactive yields, moderate molar activities and high radiochemical purity. Repro-ducibility of the production process still needs to be improved further for routine supply of copper-64 with high quality for radiolabelling procedures.

Abstract

Aufgrund ihres schnellen und aggressiven Wachstums benötigen Tumorzellen überdurchschnitt-lich viel Energie. Dieser Bedarf wird größtenteils über aerobe und anaerobe Glykolyse gedeckt, was intrazellulär zur Entstehung von sauren Stoffwechselprodukten führt. Um einer Übersäue-rung entgegenzuwirken sind Puffermoleküle wie Hydrogencarbonate notwendig, die u.a. von der Membran-assoziierten Carboanhydrase XII (CA XII) zur Verfügung gestellt werden. Aus diesem Grund ist dieses Enzym auf vielen Arten von Tumorzellen überexprimiert und stellt somit ein viel-versprechendes Zielmolekül für nuklearmedizinische Ansätze in Diagnostik und Therapie dar. Das 6A10 Fab Fragment bindet spezifisch an CA XII, weshalb es als Trägermolekül eines radio-aktiven Nuklides prädestiniert ist. In dieser Arbeit wurde das Protein mit Lutetium-177 markiert und durch diverse in-vitro und in-vivo Charakterisierungen auf seine mögliche Eignung für die lokale Therapie von Glioblastomen untersucht. Darüber hinaus ist eine diagnostische Anwendung erstrebenswert, weshalb die automatisierte Produktion des PET-Nuklids Kupfer-64 etabliert und dieses charakterisiert wurde. Schlussendlich wurde das Fab Fragment mit Kupfer-64 markiert und damit erste in-vivo Daten mittels PET-Bildgebung generiert. Das Protein wurde zunächst mit dem Chelator p-SCN-Bn-CHX-A´´-DTPA in einem Verhältnis von 1:0,96 gekoppelt und anschließend mit 1,5 GBq 177Lu/mg Fab radiomarkiert. Die radiochemische Reinheit von mehr als 96% wurde mittels Dünnschichtchromatographie ermittelt. Der Erhalt der Bindungsaffinität des modifizierten Fab Fragments am Zielmolekül CA XII wurde mittels Durch-flusszytometrie bestätigt und eine radiochemische Stabilität von über 90% nach 72 h Inkubation in verschiedenen Medien (Liquor, Plasma und Markierungspuffer) gefunden. Autoradiographie-, Biodistributions- und erste Bildgebungsexperimente wurden an Mäusen mit subkutanen Tumor-transplantaten durchgeführt. Der Tumor zeigte 6 h p.i. eine moderate Aktivitätsaufnahme von 3,1 ± 0,9 %ID/g, während signifikant hohe Aktivitätswerte in der Niere gefunden wurden, die auch 48 h p.i. noch bei 55,6 ± 13,0 %ID/g lagen. Durch autoradiographische Untersuchungen an Tu-morschnitten, gefolgt von HE-Färbungen und entsprechender mikroskopischer Charakterisie-rung konnte eine Korrelation zwischen Bereichen mit hoher Aktivitätsakkumulation und hoher Zelldichte und vice versa festgestellt werden. Die Verteilung des radioaktiven Konjugats konnte außerdem in ersten Bildgebungsexperimenten (planare Szintigraphie und SPECT/CT) visualisiert und ein Tumor-zu-kontralateral Verhältnis von 2,4 (5 h p.i.) bestätigt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Konjugation und Radiomarkierung des 6A10 Fabs mit p-NCS-Bn-NODA-GA und Kupfer-64 angestrebt, um erste Information zum in-vivo Verhalten der Verbindung mittels PET-Bildgebung und Biodistribution zu erhalten. Dazu wurde die Herstellung des Nuklids unter Verwendung der automatisierten Alceo-Module etabliert und das Produkt hin-sichtlich seiner Eignung zur Radiomarkierung von Proteinen charakterisiert. Elementares Nickel-64 wurde mit Ausbeuten über 96% abgeschieden, automatisch im Strahlengang des Zyklotrons positioniert und bis zu 5 h lang bei 11,0 – 14,5 MeV und 20 - 30 µA mit Protonen bestrahlt. Aus-beuten von maximal 5 GBq konnten erzielt werden. Entstandene Nebenprodukte wurden mittels Gammaspektroskopie quantifiziert und auf das Ende der Bestrahlung zerfallskorrigiert (0,03 ± 0,10 At% 55Co, 0,004 ± 0,014 At% 57Co und 1,4 ± 3,4 At% 61Co). Das Nuklidgemisch wurde mit-tels Ionenchromatographie aufgetrennt, was zu einer radiochemischen Reinheit der 64Cu-Fraktion von über 99% führte. Nach Volumenreduktion lag das Produkt in 400 µl einer 0,1 M HCl vor. Die molare Aktivität des Kupfers, ermittelt durch Titration mit TETA, konnte auf 133 GBq/µmol angehoben werden, nachdem durch Optimierung der Reinigungsmethodik der Anteil an nicht-radioaktiven Metallkontaminationen, quantifiziert mittels ICP-OES Messungen, sig-nifikant reduziert wurde. Erste Biodistributionsergebnisse mit dem 64Cu-markiertem 6A10 Fab zeigten eine hohe Tumoranreicherung von bis zu 6,9 ± 1,6 %ID/g 5 h p.i.. Die PET-Quantifizierung ergab 4 h p.i. ein Tumor-zu-kontralateral Verhältnis von 11,8 ± 0,3 (n = 2). Die ersten in-vivo und in-vitro Charakterisierungen des 6A10 Fab in Hinblick auf zukünftige the-rapeutische und diagnostische Anwendungen zeigten vielversprechende Ergebnisse. Durch die Radiomarkierung mit Lutetium-177 in Hinblick auf die lokale Applikation in das Gehirn, konnte eine moderate Tumoranreicherung und eine ausreichende radiochemische Stabilität unter physiologi-schen Bedingungen im systemisch applizierten Xenograft-Modell nachgewiesen werden. Zusätz-lich dazu zeigte die mangelnde Anreicherung im Gehirn, dass das Radiokonjugat die Blut-Hirn-Schranke nicht passiert. Weitere Informationen über das in-vivo Verhalten des Moleküls nach der lokalen Applikation können zudem durch die Etablierung eines anwendungsnäheren Tiermodells generiert werden. Die systemische Gabe des 64Cu-markierten Proteins führte zu einer guten Tumoranreicherung und ermöglichte hochauflösende PET-Bildgebung, was zu weiteren Studien in Hinblick auf die Anwendung des Konjugats im Bereich der Krebsdiagnostik motiviert. Die wissenschaftliche Rele-vanz dieser ersten Ergebnisse sollte in ausführlichen Biodistributions- und Bildgebungsstudien bestätigt werden um das weitere Vorgehen in Richtung der humanen Anwendung zu rechtferti-gen. Die genutzten Alceo-Module ermöglichen die automatische Produktion von Kupfer-64 in gu-ter radioaktiver Ausbeute, moderaten molaren Aktivitäten und hoher radiochemischer Reinheit. Die Reproduzierbarkeit des Herstellungsprozesses sollte durch weitere Modifikationen weiter verbessert werden, um die regelmäßige Bereitstellung von Kupfer-64 in hoher Qualität für Radi-omarkierungszwecke gewährleisten zu können.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: 6A10 Fab; 177-Lutetium; 64-Copper; Radiochemistry
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 14. Januar 2019
• 1. Bericht­erstatter:in: Böning, Guido