Establishment and implementation of an electrophysiological screening assay for the assessment of the effect of receptor-active substances on nicotinic acetylcholine receptors

Scheffel, Corinna (2018): Establishment and implementation of an electrophysiological screening assay for the assessment of the effect of receptor-active substances on nicotinic acetylcholine receptors: therapeutics in organophosphate poisoning = Etablierung und Implementierung eines elektrophysiologischen Screening Assays zur Untersuchung der Wirkung rezeptoraktiver Substanzen an nikotinischen Acetylcholinrezeptoren : Therapeutika bei Organophosphatvergiftungen. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Die primäre Wirkung von phosphororganischen (OP) Verbindungen, zu denen Pestizide und Nervenkampfstoffe gehören, beruht auf der irreversiblen Hemmung der Acetylcholinesterase (AChE) sodass die katalytische Hydrolyse von Acetylcholin (Ach) ausbleibt. ACh akkumuliert unkontrolliert im synaptischen Spalt und verursacht infolge einer Überstimulation und anschließender Desensitisierung nikotinischer (nAChR) Rezeptoren und Überstimulation muskarinischer (mAChR) Rezeptoren eine cholinerge Krise welche unbehandelt zum Tod durch zentrale und periphere Atemlähmung führen kann. Die derzeitige Standardtherapie umfasst die Reaktivierung OP-gehemmter AChE durch mono- oder bisquarternäre Pyridiniumoxime und kompetitive Antagonisierung von mAChR durch Atropin. Dabei werden durch die derzeitig verfügbare Pharmakotherapie ausschließlich muskarinische Symptome behandelt wohingegen nikotinerge Effekte am nAChR nicht direkt adressiert werden. Dementsprechend stellt die direkte Intervention an nAChR einen innovativen und generischen therapeutischen Ansatz gegen OP Verbindungen dar, um die Oxim-Therapie zu ergänzen. Da es bisher noch kein Breitband-Oxim gibt und insbesondere bei Vergiftungen mit Soman oder Tabun die Reaktivierung mit Oxim nicht ausreichend ist, wird die Notwendigkeit einer solchen alternativen Therapiestrategie deutlich. Daher sind Verbindungen, die als positive allosterische Modulatoren (PAM) wirken und die Desensitisierung der nAChR vorbeugen bzw. diese wieder aufheben können von großer therapeutischer Bedeutung. Die Bispyridinium (BP) Verbindung MB327, welche einen positiven therapeutischen Effekt vermittelte, aber keine ausreichend hohe Effektivität zeigte, diente in dieser Studie als Leitstruktur für die Synthese einer Reihe strukturell analoger BP-Verbindungen (PTM Verbindungen). In dieser Arbeit wurde die Wirkung der sogenannten PTM Verbindungen auf die Funktion der nAChR mittels der Etablierung eines automatisierten Ganzzell-Patchclamp-Verfahrens an CHO-K1-Zellen untersucht, die mit dem humanen α7-nAChR (hα7-nAChR) stabil transfiziert wurden (CHO/RIC-3/hα7-nAChR). Die CHO-K1 Zelllinie wurde anstelle der GH4C1 Zelllinie für die stabile Transfektion von hα7-nAChR verwendet, da grundlegende elektrophysiologische Eigenschaften der Membranen beiden Säugerzelllinien zeigten, dass die CHO-K1 Zelllinie aufgrund der niedrigen spannungs- und ligandengesteuerten Leitfähigkeit gut geeignet war im Gegensatz zur GH4C1 Zelllinie, welche eine gemäßigte spannungsgesteuerte Leitfähigkeit besaß, die die Untersuchung der nAChR Funktion mit der Patch Clamp Methode stören könnte. Die Erfolgsrate der Sealbildung wurde für die Etablierung eines effizienten Screening-Verfahrens optimiert, indem die zellulären Parameter und Einstellungen angepasst wurden, einschließlich der Einstellung des Ansaugdrucks der Zelle und des Drucks auf die Zelle während der Messung, der Festlegung des Bereichs der Zellpassagen für die Messung sowie die zusätzliche Verwendung einer Ca2+-reichen Lösung, die dazu diente die Sealbildung unmittelbar vor der Messung zu verstärken. Zudem wurde die Applikation der Testlösung mit einer Durchflussrate von 171 µl/s zugegeben sodass die Zellen für 233 ms gegenüber der Testlösung exponiert wurden. Im Falle der Desensitisierung von nAChR waren ein Zeitintervall von 3 Minuten und zwei Waschschritte erforderlich, um vor der nächsten Applikation der Testlösung eine vollständige Regeneration des leitfähigen Zustands der Rezeptoren zu gewährleisten. Die schnell verlaufende Reaktionskinetik der nAChR Aktivierung zeigte einen biphasischen Verlauf der Dosis-Wirkungsbeziehungen mit verschiedenen klassischen Agonisten, sodass sich bei niedrigen Agonist-Konzentrationen die Aktivierung erhöhte und bei hohen Konzentrationen die Aktivierung gehemmt wurde. Dadurch wurden die verschiedenen Konformationszustände der Rezeptoren durch klassische orthosterische Agonisten aufgezeigt, welche die hα7-nAChR bei niedrigen Konzentrationen aktivierten und bei hohen Konzentrationen die Inaktivierung bzw. Desensitisierung induzierten. Die positiv allosterische Modulation von Agonisten-induzierter Aktivierung durch PNU-120596 ergab eine Verstärkung der Agonist-induzierten Stromamplitude sowie eine verlängerte Dauer der Stromantwort, welche eine Verlängerung der durchschnittlichen Öffnungsdauer der hα7-nAChR anzeigte. Durch Strom-Spannungs-Beziehungen von CHO-K1/RIC-3/hα7-nAChR-Zellen ohne und mit Agonist-induzierter Stimulierung und allosterischer Modulation durch PNU-120596, sowie spezifische hα7-nAChR Antagonisierung mit Methyllycaconitin konnte die spezifische hα7-nAChR Expression und elektrophysiologische Eigenschaften bezüglich der selektiven Ionenpermeabilität der hα7-nAChR für Na+ und Ca2+ nachgewiesen werden. Bei der folgenden Screening-Methode wurde die Wirkung von BP-Verbindungen auf die nAChR-Aktivierung untersucht, um Struktur-Wirkungs-Beziehungen zu identifizieren. Dabei wurden durch BP-Verbindungen zwei verschiedene intrinsische Aktivitäten auf die AChR-Aktivierung aufgezeigt. Die erste umfasste die Potenzierung der nAChR-Aktivierung durch PNU-120596, MB327 und fünf symmetrische PTM-Verbindungen mit einer tert-Butyl oder einer Methoxy Gruppe an der Position 2, 3 und 4 beider Pyridiniumringe. Die zweite zeigte dass die PTM-Verbindungen mit einer Dimethylaminogruppe an der Position 3, einer Isopropylgruppe an der Position 2, 3 und 4 oder mehr als einer substituierten Gruppe an beiden Pyridiniumringen die nAChR-Aktivierung inhibierten. Die Bestimmung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen ergab, dass die Potenzierung der nAChR-Aktivierung von der Position und der chemischen Struktur und der substituierten Gruppe der Testsubstanz abhängt, da BP-Verbindungen, die eine tert-Butyl-Gruppe oder eine Methoxy-Gruppe an der Position 3 und 4 tragen, eine höhere Amplifikation der Stromantwort zeigten als eine solche Substitution an der Position 2. Untersuchungen zur Wiederherstellung der Rezeptorfunktion nach Desensitisierung zeigten, dass diese BP-Verbindungen die Desensitisierung aufhoben und dabei vergleichbare Struktur-Aktivitäts-Beziehungen in ihrer Effektivität wie zuvor bei den Aktivierungsprofilen zeigten. Stromantwortprofile der nAChR-Aktivierung sowie der nAChR Desensitisierung unter Einfluss der BP-Verbindungen waren weniger ausgeprägt aber analog zu PNU-1204596 Stromantwortprofilen, einem bekannten PAM, und die Rezeptoren waren alleine durch BP-Verbindungen in Abwesenheit des Agonisten Nikotin nicht aktivierbar. Demnach war die zugrundeliegende Wirkungsweise der BP-Verbindungen durch eine Typ II allosterische Wechselwirkung mit den Rezeptoren naheliegend, die durch eine Vorbeugung sowie der Aufhebung der nAChR Desensitisierung gekennzeichnet ist. Zusammenfassend konnte in dieser Studie eine stabile Screening-Methode entwickelt werden, um strukturelle Anforderungen an Testverbindungen zu identifizieren, die die nAChR-Desensitisierung vorbeugen und aufheben können, um vielversprechende Leit-Strukturen zu identifizieren, die eine positive pharmakologische Wirkung nach OP-Vergiftung vermitteln um diese effizient behandeln zu können.

Abstract

The primary toxic action of organophosphorus (OP) compounds including pesticides and highly toxic nerve agents is the irreversible inhibition of acetylcholinesterase (AChE), impairing hydrolysis of acetylcholine (ACh). Accumulation of ACh within cholinergic synapses gives rise to overstimulation of nicotinic (nAChR) and muscarinic (mAChR) receptors causing a cholinergic syndrome and finally leads to respiratory arrest due to paralysis of the respiratory muscles and the central respiratory system. Medical countermeasure of OP poisoning comprises reactivation of inhibited AChE by mono- or bisquarternary pyridinium oximes and competitive antagonism at mAChR by atropine. Thereby, the currently available pharmacotherapy mitigates only muscarinic and does not directly target nicotinic effects. Accordingly, direct intervention at nAChR may be a promising generic approach against OP intoxications to complement oxime-therapy. The need of such a therapeutic strategy is urged in cases of nerve agents resistant to reactivation by oximes (e.g. soman, tabun) and in case of suicidal high load pesticide poisoning as no broad-spectrum oxime has been identified yet. In this context, compounds acting as positive allosteric modulators (PAM) that reduce or reverse nAChR desensitization became of increasing therapeutic relevance wherein the bispyridinium (BP) non-oxime MB327 found to mediate a positive therapeutic effect in vitro although not to a sufficiently high degree was used as a lead structure for the synthesis of a series of structural BP analogues. In this study, functional activities of these BP, so called PTM compounds, were identified by establishing a whole-cell patch clamp method performed under voltage-clamping conditions applied with planar electrodes in an automatic system (Nanion Technologies GmbH, Munich) to record human α7-nAChR (hα7-nAChR) stably expressed in a CHO-K1 cell line (CHO/RIC-3/hα7-nAChR). To this end, elucidation of basic electrophysiological characteristics of two mammalian cell lines, GH4C1 and CHO-K1 for use as host cell system of hα7-nAChR showed that CHO-K1 cell line was well suited verified by its low voltage- and ligand-gated conductance. In contrast, moderate voltage-gated conductance detected in GH4C1 may cause interference in voltage clamped screening method for the investigation of nAChR function. The seal success rate was optimized for the establishment of an efficient screening method of hα7-nAChR function in CHO-K1/RIC-3/hα7-nAChR cells by adjusting cellular parameters and settings including adjustment of the pressure applied to capture and to hold the cells, cell passage range used and addition of a Ca2+ rich solution serving as a “seal enhancer” prior to measurement. Moreover, investigation of flow rate of compound solution application revealed most pronounced nicotine-induced current signal intensity at a flow rate of 171 µl/s exposing the cells for 233 ms to a test solution. Considering recovery of receptors from desensitization, a time interval of 3 min and two washing steps between the next test solution application was required to ensure full regeneration of the desensitized state of hα7-nAChR into a conductible state. Fast kinetics of hα7-nAChR activation demonstrated biphasic dose response curves ascending at low and descending at high agonist concentrations revealing the conformational states of receptors including activation at low, inactivation and desensitization of hα7-nAChR at high agonist concentrations. Positive allosteric modulation of agonist-induced responses by PNU-120596 yielded an amplification of nicotine-induced peak current amplitude as well as a prolonged duration of the evoked response representing an elongated mean open channel conformation. Current-voltage relations of CHO-K1/RIC-3/hα7-nAChR cells under control and upon agonist-induced activation and allosteric modulation by PNU-120596 as well as specific hα7-nAChR antagonization with methyllycaconitine verified specific hα7-nAChR expression and electrophysiological properties with respect to selective ion permeability of hα7-nAChR to Na+ and Ca2+. In the following screening method, the effect of BP compounds on hα7-nAChR activation was investigated to identify structure-activity relations and revealed two different intrinsic activities of BP compounds on hα7-nAChR activation comprising a potentiation of hα7-nAChR activation by MB327 and five symmetrical PTM compounds bearing a tert-butyl or a methoxy-group at 2-,3- and 4-position of both pyridinium rings. In contrast, residual PTM compounds including those with a dimethylamino-group at 3-position, isopropyl-group at 2-,3- and 4-position or more than one substituted group at both pyridinium rings inhibited nAChR function. Elucidation of structure-activity yielded that potentiation was most pronounced with MB327 and was dependent on the position and chemical structure of substituted groups as BP compounds carrying a tert-butyl group or a methoxy-group showed a higher amplification of current response with a substitution at position 3 and 4 compared to position 2. By corresponding activity-relations of BP compounds, MB327 and PTM compounds bearing a tert-butyl or a methoxy-group were able to restore desensitized hα7-nAChR. Because these compounds did not activate hα7-nAChR by themselves without agonist and current response profile of activated and desensitized nAChR reflected the one obtained with the representative type II PAM PNU-120596, the underlying mechanism of action by these compounds was indicative for a type II allosteric mechanism able to prevent and recover receptors from desensitization. In summary, this study served to develop a stable screening method to identify structural requirements of test compounds to prevent and reverse hα7-nAChR desensitization to unravel promising lead structures capable to convey a positive pharmacological effect after OP poisoning.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 11. Dezember 2018
• 1. Bericht­erstatter:in: Worek, Franz