Osteogene Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen in thermoresponsiven Pluronic® P123–Hydrogelen mit Osteoinduktion durch den Wachstumsfaktor rhBMP-7

Jedelhauser, Claudia Catrine (2018): Osteogene Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen in thermoresponsiven Pluronic® P123–Hydrogelen mit Osteoinduktion durch den Wachstumsfaktor rhBMP-7. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Einleitung: Die Entwicklung moderner Therapien zur Frakturversorgung, als Alternative zum Goldstandard der autologen Knochentransplantate, stellt ein zentrales Thema der Regenerativen Medizin dar. Vielversprechende Materialien sind thermoresponsive Hydrogele, z.B. Pluronic® P123, die mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) besiedelt werden. Zur Osteoinduktion können Wachstumsfaktoren, z.B. rhBMP- 7, beitragen. Ziel der Dissertation war die osteogene Differenzierung von hMSC in mit Poly(etherurethan) kettenverlängertem Pluronic® P123 (HDI-, BDI-Hydrogel). Daneben wurde der Einfluss von Kollagen I auf das Zellüberleben sowie der Effekt von rhBMP-7 auf die Osteoinduktion der hMSC analysiert. Material und Methoden: Pluronic® P123 wurden auf Eis mit 20 % Kollagen I modifiziert und mit 5 x 105 hMSC besiedelt. Die Mizellenbildung erfolgte bei 37 °C. Zellüberleben und Morphologie im Hydrogel wurden durch WST-Assay und Lebend-Tot-Färbung untersucht. Die Quantifizierung der Osteogenese durch osteogenes Differenzierungsmedium und additiver Stimulation durch rhBMP-7 erfolgte, neben Alizarin-Rot-Assay und ALP-Assay, durch histologische Färbungen von Kryoschnitten sowie Genexpressionsprofilen. Ergebnisse: Das Zellüberleben nahm über 21 Tage ab, wobei die Viabilität durch 20 % Kollagen I signifikant höher war. Die hMSC zeigten im Hydrogel dreidimensionale Zellsphäroide. Das BDI-Hydrogel lieferte dabei im Vergleich bessere Resultate hinsichtlich Zellviabilität als das HDI-Hydrogel. Die im 80 % BDI-Hydrogel angesiedelten hMSC konnten nach 25 Tagen Stimulation erfolgreich osteogen differenziert werden. Durch rhBMP-7 (100 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/ml) wurde die Osteogenese gesteigert. Diskussion: Die Besonderheit in der praktischen Arbeit mit Pluronic® P123 lag in seinem temperaturabhängigen Phasenzustand, sowie seiner Mizellenstruktur. Zur osteogenen Differenzierung wurden die Bedingungen im Hydrogel optimiert. Die Bereitstellung von Zelladhäsionssequenzen durch 20 % Kollagen I resultierte in einem signifikant höheren Zellüberleben. Alle Nachweismethoden zeigten eine erfolgreiche osteogene Differenzierung der hMSC im Vergleich zur Negativkontrolle. Durch rhBMP-7 konnte die Osteogenese signifikant gesteigert werden. Die Konzentration von 250 ng/ml rhBMP- 7 war am effizientesten. Schlussfolgerung und Ausblick: Das thermoresponsive BDI-Hydrogel bietet nach Modifikation mit Kollagen I ein vielversprechendes Material für das Tissue Engineering von Knochengewebe. Durch die Stimulation mit rhBMP-7 kann der Effekt der osteogenen Differenzierung signifikant gesteigert werden. Weitere Meilensteine in der Entwicklung dieses Hydrogels könnte die Induktion der Angiogenese zur Vaskularisation des Gewebes sowie in vivo Versuche sein. Daneben könnte das Pluronic® P123 auch als reiner Pharmakonträger von z.B. rhBMP- 7 eingesetzt werden.

Abstract

Introduction: A central issue of regenerative medicine is the development of modern therapies for fracture management as an alternative to autografts. Promising materials are thermoresponsive hydrogels, as pluronic® P123. These materials are seeded with human mesenchymal stem cells (hMSC). For osteoinduction of these cells growth factors, as rhBMP-7, are used. The aim of this dissertation was the osteogenic differentiation of hMSC seeded pluronic® P123, which is chain extended by poly(etherurethans) (HDI-, BDI-hydrogel). Additionally the influence of modification with collagen I on cell viability and the effect of rhBMP-7 on osteoinduction of hMSC was analyzed. Materials and methods: Pluronic® P123 was modificated with 20 % collagen I on ice and seeded with 5 x 105 hMSC. At 37 °C the hydrogel organized to micelles. Cell viability and morphology in the hydrogel were analyzed by WST assay and live-dead assay. The osteogenic differentiation by osteogenic differentiation media and additive stimulation with rhBMP- 7 was quantificated by alizarin red assay, ALP assay and also staining of cryohistology and gene expression profiles. Results: Cell survival decreased over 21 days. Modification with 20 % collagen I resulted in a significant higher viability. The cells organized to three-dimensional spheroids in the hydrogel. In comparison to the HDI hydrogel, the BDI hydrogel showed a better cell viability. The hMSC, seeded at 80 % BDI hydrogel, resulted in an osteogenic differentiation after incubation with osteogenic differentiation media over 25 days. By additionally stimulation with rhBMP-7 (100 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/ml) the osteogenesis was increased significantly. Discussion: Application of pluronic® P123 prepared some specifities because of its temperature-responsive phase and its micelles. For osteogenic differentiation the conditions in the hydrogel were improved. The cell viability was improved by providing cell adhesion domains by 20 % collagen I. Every method showed a successful osteogenic differentiation of hMSC in comparison to the negative control. Stimulation with rhBMP- 7 increased the osteogenesis significantly. The concentration of 250 ng/ml rhBMP- 7 was most efficient. Conclusion and outlook: The thermoresponsive BDI hydrogel with 20 % collagen I is a promising material of tissue engineering of bone. Stimulation with rhBMP-7 can increase the effect of osteogenic differentiation significantly. Further steps in the development of this hydrogel could be the induction of angiogenesis for vascularization of the tissue as well as in vivo experiments. Also pluronic® P123 could used as carrier for drugs, as rhBMP-7.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Regenerative Medizin, Tissue Engineering, Hydrogel, Pluronic, Poloxamer, BMP 7, MSC, osteogen
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 20. Dezember 2018
• 1. Bericht­erstatter:in: Schieker, Matthias