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Entwicklung und Anwendung eines in vitro Co-Kultur-Modells der Haut zur Identifizierung potentieller Therapeutika bei Schwefellost-Vergiftungen
Entwicklung und Anwendung eines in vitro Co-Kultur-Modells der Haut zur Identifizierung potentieller Therapeutika bei Schwefellost-Vergiftungen
Schwefellost (S-Lost) ist ein blasenbildender chemischer Kampfstoff der vor 100 Jahren zum ersten Mal militärisch eingesetzt wurde. Als es 2015 nachweislich zur Ausbringung von S-Lost in Syrien kam, rückten die unzulänglichen Therapiemöglichkeiten einer S-Lost-Vergiftungen wieder in den Fokus der Öffentlichkeit. Bei einer Vergiftung mit S-Lost sind besonders Augen, Lunge und Haut betroffen. Abhängig von der aufgenommenen Giftmenge kommt es zu Nekrose, Apoptose und Entzündung in den exponierten Organen. Bis dato ist noch keine kausale Therapie möglich und die Behandlung erfolgt lediglich symptomorientiert und zum Teil sogar empirisch. Ziel der wissenschaftlichen Arbeit war die Etablierung und Erprobung eines in vitro Co-Kultur-Modells aus Keratinozyten (HaCaT) und Immunzellen (THP-1), das die Physiologie der Haut besser darstellt als eine HaCaT-Monokultur. Mit diesem Modell ist es möglich potentielle Therapeutika gegen S-Lost-Intoxikation zu identifizieren und die aktuellen Therapievorschläge zu evaluieren, wobei gleichzeitig die Notwendigkeit für Tierversuche verringert wird. Bei der Etablierung des Co-Kultur-Modells wurden zwei Versuchsansätze gewählt. Zum einen wurden vergiftete HaCaT-Zellen mit ungeschädigten THP-1-Zellen vergesellschaftet, um so das Einwandern von Makrophagen in den Entzündungsherd zu simulieren. Es konnte gezeigt werden, dass unbehandelte THP-1-Zellen die Toxizität von S-Lost nicht erhöhen, sondern im Gegenteil bei den stärker vergifteten HaCaT-Zellen die Toxizität zum Teil signifikant verringern. Zum anderen wurde ein Versuchsansatz gewählt, in dem die HaCaT-Zellen zuerst mit den THP-1-Zellen vergesellschaftet wurden, um dann simultan mit S-Lost vergiftet zu werden. Hier wurde die Vergiftung von in der Haut vorhanden Immunzellen simuliert. Die Ergebnisse zeigten, dass bereits ein Verhältnis von 2 % THP-1-Zellen im Vergleich zur ausgesäten Zahl an HaCaT-Zellen ausreichend ist um die Nekrose, Apoptose und Entzündung nach einer S-Lost-Vergiftung hochsignifikant zu steigern. Das Co-Kultur-Modell lieferte daher Ergebnisse, die näher an den in vivo Bedingungen liegen als eine HaCaT-Monokultur. Das Co-Kulturmodell mit simultaner Vergiftung der HaCaT- und THP-1-Zellen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit genutzt um die Effektivität von anti-inflammatorischen Arzneistoffen (Dexamethason, Ibuprofen und Diclofenac) zu testen und Therapieempfehlungen für eine Vergiftung abzuleiten. Dabei wurde zu Vergleichszwecken jeweils eine HaCaT-Monokultur unter gleichen Bedingung parallel behandelt. In den Ergebnissen bewirkte Dexamethason in geringen Konzentrationen eine signifikante Verringerung der Apoptose und der Interleukinausschüttung, die allerdings in der Monokultur stärker ausgeprägt war als in der Co-Kultur. Dies lässt vermuten, dass der protektive Effekt des Dexamethasons nicht in erster Linie durch eine Beeinflussung von Immunzellen zu Stande kommt. Ibuprofen führte in den eingesetzten Konzentrationen zu einer Verstärkung der Zytotoxizität des S-Lostes, sowohl in der Mono- als auch in der Co-Kultur. Daher ist eine Therapie von S-Lost-Vergiftungen mit Ibuprofen nicht empfehlenswert. Diclofenac war in der Lage, die Toxizität von S-Lost zu verringern, wobei diese Effekte in der Co-Kultur besonders deutlich werden, was auf eine Beeinflussung der Immunzellen durch Diclofenac hindeutet. Die Herausarbeitung der protektiven Effekte des Diclofenacs in vitro waren nur durch die neu etablierte Co-Kultur aus HaCaT- und THP-1-Zellen möglich, während sie bei einem regulären Screening mit einer HaCaT-Monokultur unterschätzt worden wären. Insgesamt wurde also ein valides Co-Kultur-Modell der Haut zur Testung potentieller Therapeutika gegen S-Lost-Vergiftung etabliert, wobei sich das Modell bereits in der Erprobung erster Substanzen bewährt hat., Sulfur mustard (SM) is a vesicant agent that had its first military use 100 years ago, at Ypres. Recently, the use of SM in Syria 2015 was verified and moved the difficulties which are linked with the treatment of SM intoxications back into the spotlight. A SM intoxication especially affects eyes, lung and skin and leads dose dependently to necrosis, apoptosis and inflammation. No causal antidote to counteract SM toxicity exits, so far. Therefore, treatment is mainly symptomatic and in some cases even empiric. Aim of this work was the establishment and testing of a co-culture model of the skin, composed of keratinocytes (HaCaT) and immunocompetent cells (THP-1). This in vitro model reflects the physiology of the skin more closely than a monoculture of keratinocytes and can be used to identify potential candidate substances for the treatment of SM intoxications and evaluation of the current therapy recommendations, respectively. Moreover, it diminishes the need for animal trials. For the validation of the co-cultur-model we used two different strategies. Firstly, we inoculated unexposed THP-1 cells with SM-exposed HaCaT cells. This approach simulates the migration of macrophages from the blood into the inflamed tissue. Our results showed, that healthy THP-1 cells do not aggravate the course of a SM intoxication. On the contrary, the THP-1 cells significantly reduced SM toxicity in the more severely poisoned cells, if the number of THP-1 cells was sufficient. Secondly, adherent HaCaT-cells were inoculated with THP-1 cells before the SM exposure and thus being poisoned simultaneously. The data showed, that a ratio of 2 % THP-1 cells relating to the number of seeded HaCaT cells is sufficient to aggravate necrosis, apoptosis and inflammation in a highly significant manner. In conclusion, the co-culture-model containing HaCaT and THP-1 cells mimics the physiology of the skin in vitro more closely than a HaCaT monoculture. The co-culture model which exposes the HaCaT and THP-1 cells simultaneously to SM has been used in further experiments to ascertain the efficacy of anti-inflammatory drugs against SM intoxication and draw recommendations for SM treatment thereof. For comparability reasons a HaCaT monoculture was treated under the same conditions as the co-culture. In the results, dexamethasone significantly decreased apoptosis and interleukin production when applied in low concentrations. This effect was in the monoculture more clearly than in the co-culture, which led to the conclusion, that the protective effects of dexamethason did not arise from a modulation of immunocompetent cells in first line. Ibuprofen, in the used concentrations, led to a strong increase in SM cytotoxicity in the mono- as well as the co-culture. For that reason, ibuprofen cannot be recommended for the treatment of SM intoxications. Diclofenac on the other hand was able to attenuate SM toxicity. The protective effect was stronger in the co-culture compared to the monocultur, which indicates that diclofenac modulates the response of the immunocompetent cells to a SM exposure. The full protective effects of diclofenac could only be carved out by the use of the new established co-culture model while they would have been underestimated in a HaCaT monoculture screening. In summary, the establishment of a valid co-culture–model of the skin was successful. The model was also used to evaluate anti-inflammatory compounds which generated treatment recommendations for the therapy of SM intoxications.
Not available
Menacher, Georg
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Menacher, Georg (2018): Entwicklung und Anwendung eines in vitro Co-Kultur-Modells der Haut zur Identifizierung potentieller Therapeutika bei Schwefellost-Vergiftungen = Development and application of an in vitro co-culture model of the skin for the identificaton of therapeutics against sulfur mustard intoxications. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Schwefellost (S-Lost) ist ein blasenbildender chemischer Kampfstoff der vor 100 Jahren zum ersten Mal militärisch eingesetzt wurde. Als es 2015 nachweislich zur Ausbringung von S-Lost in Syrien kam, rückten die unzulänglichen Therapiemöglichkeiten einer S-Lost-Vergiftungen wieder in den Fokus der Öffentlichkeit. Bei einer Vergiftung mit S-Lost sind besonders Augen, Lunge und Haut betroffen. Abhängig von der aufgenommenen Giftmenge kommt es zu Nekrose, Apoptose und Entzündung in den exponierten Organen. Bis dato ist noch keine kausale Therapie möglich und die Behandlung erfolgt lediglich symptomorientiert und zum Teil sogar empirisch. Ziel der wissenschaftlichen Arbeit war die Etablierung und Erprobung eines in vitro Co-Kultur-Modells aus Keratinozyten (HaCaT) und Immunzellen (THP-1), das die Physiologie der Haut besser darstellt als eine HaCaT-Monokultur. Mit diesem Modell ist es möglich potentielle Therapeutika gegen S-Lost-Intoxikation zu identifizieren und die aktuellen Therapievorschläge zu evaluieren, wobei gleichzeitig die Notwendigkeit für Tierversuche verringert wird. Bei der Etablierung des Co-Kultur-Modells wurden zwei Versuchsansätze gewählt. Zum einen wurden vergiftete HaCaT-Zellen mit ungeschädigten THP-1-Zellen vergesellschaftet, um so das Einwandern von Makrophagen in den Entzündungsherd zu simulieren. Es konnte gezeigt werden, dass unbehandelte THP-1-Zellen die Toxizität von S-Lost nicht erhöhen, sondern im Gegenteil bei den stärker vergifteten HaCaT-Zellen die Toxizität zum Teil signifikant verringern. Zum anderen wurde ein Versuchsansatz gewählt, in dem die HaCaT-Zellen zuerst mit den THP-1-Zellen vergesellschaftet wurden, um dann simultan mit S-Lost vergiftet zu werden. Hier wurde die Vergiftung von in der Haut vorhanden Immunzellen simuliert. Die Ergebnisse zeigten, dass bereits ein Verhältnis von 2 % THP-1-Zellen im Vergleich zur ausgesäten Zahl an HaCaT-Zellen ausreichend ist um die Nekrose, Apoptose und Entzündung nach einer S-Lost-Vergiftung hochsignifikant zu steigern. Das Co-Kultur-Modell lieferte daher Ergebnisse, die näher an den in vivo Bedingungen liegen als eine HaCaT-Monokultur. Das Co-Kulturmodell mit simultaner Vergiftung der HaCaT- und THP-1-Zellen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit genutzt um die Effektivität von anti-inflammatorischen Arzneistoffen (Dexamethason, Ibuprofen und Diclofenac) zu testen und Therapieempfehlungen für eine Vergiftung abzuleiten. Dabei wurde zu Vergleichszwecken jeweils eine HaCaT-Monokultur unter gleichen Bedingung parallel behandelt. In den Ergebnissen bewirkte Dexamethason in geringen Konzentrationen eine signifikante Verringerung der Apoptose und der Interleukinausschüttung, die allerdings in der Monokultur stärker ausgeprägt war als in der Co-Kultur. Dies lässt vermuten, dass der protektive Effekt des Dexamethasons nicht in erster Linie durch eine Beeinflussung von Immunzellen zu Stande kommt. Ibuprofen führte in den eingesetzten Konzentrationen zu einer Verstärkung der Zytotoxizität des S-Lostes, sowohl in der Mono- als auch in der Co-Kultur. Daher ist eine Therapie von S-Lost-Vergiftungen mit Ibuprofen nicht empfehlenswert. Diclofenac war in der Lage, die Toxizität von S-Lost zu verringern, wobei diese Effekte in der Co-Kultur besonders deutlich werden, was auf eine Beeinflussung der Immunzellen durch Diclofenac hindeutet. Die Herausarbeitung der protektiven Effekte des Diclofenacs in vitro waren nur durch die neu etablierte Co-Kultur aus HaCaT- und THP-1-Zellen möglich, während sie bei einem regulären Screening mit einer HaCaT-Monokultur unterschätzt worden wären. Insgesamt wurde also ein valides Co-Kultur-Modell der Haut zur Testung potentieller Therapeutika gegen S-Lost-Vergiftung etabliert, wobei sich das Modell bereits in der Erprobung erster Substanzen bewährt hat.

Abstract

Sulfur mustard (SM) is a vesicant agent that had its first military use 100 years ago, at Ypres. Recently, the use of SM in Syria 2015 was verified and moved the difficulties which are linked with the treatment of SM intoxications back into the spotlight. A SM intoxication especially affects eyes, lung and skin and leads dose dependently to necrosis, apoptosis and inflammation. No causal antidote to counteract SM toxicity exits, so far. Therefore, treatment is mainly symptomatic and in some cases even empiric. Aim of this work was the establishment and testing of a co-culture model of the skin, composed of keratinocytes (HaCaT) and immunocompetent cells (THP-1). This in vitro model reflects the physiology of the skin more closely than a monoculture of keratinocytes and can be used to identify potential candidate substances for the treatment of SM intoxications and evaluation of the current therapy recommendations, respectively. Moreover, it diminishes the need for animal trials. For the validation of the co-cultur-model we used two different strategies. Firstly, we inoculated unexposed THP-1 cells with SM-exposed HaCaT cells. This approach simulates the migration of macrophages from the blood into the inflamed tissue. Our results showed, that healthy THP-1 cells do not aggravate the course of a SM intoxication. On the contrary, the THP-1 cells significantly reduced SM toxicity in the more severely poisoned cells, if the number of THP-1 cells was sufficient. Secondly, adherent HaCaT-cells were inoculated with THP-1 cells before the SM exposure and thus being poisoned simultaneously. The data showed, that a ratio of 2 % THP-1 cells relating to the number of seeded HaCaT cells is sufficient to aggravate necrosis, apoptosis and inflammation in a highly significant manner. In conclusion, the co-culture-model containing HaCaT and THP-1 cells mimics the physiology of the skin in vitro more closely than a HaCaT monoculture. The co-culture model which exposes the HaCaT and THP-1 cells simultaneously to SM has been used in further experiments to ascertain the efficacy of anti-inflammatory drugs against SM intoxication and draw recommendations for SM treatment thereof. For comparability reasons a HaCaT monoculture was treated under the same conditions as the co-culture. In the results, dexamethasone significantly decreased apoptosis and interleukin production when applied in low concentrations. This effect was in the monoculture more clearly than in the co-culture, which led to the conclusion, that the protective effects of dexamethason did not arise from a modulation of immunocompetent cells in first line. Ibuprofen, in the used concentrations, led to a strong increase in SM cytotoxicity in the mono- as well as the co-culture. For that reason, ibuprofen cannot be recommended for the treatment of SM intoxications. Diclofenac on the other hand was able to attenuate SM toxicity. The protective effect was stronger in the co-culture compared to the monocultur, which indicates that diclofenac modulates the response of the immunocompetent cells to a SM exposure. The full protective effects of diclofenac could only be carved out by the use of the new established co-culture model while they would have been underestimated in a HaCaT monoculture screening. In summary, the establishment of a valid co-culture–model of the skin was successful. The model was also used to evaluate anti-inflammatory compounds which generated treatment recommendations for the therapy of SM intoxications.