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Stimulierung der Faktor Xa-Bildung und Aktivierung von Tissue Factor durch Proteine des endoplasmatischen Retikulums in vitro
Stimulierung der Faktor Xa-Bildung und Aktivierung von Tissue Factor durch Proteine des endoplasmatischen Retikulums in vitro
TF ist zentral bei der Initiierung des Koagulationsprozesses im Rahmen der extrinsischen Blutgerinnung. Vorarbeiten zeigten, dass TF jedoch nicht an der Spitze der Blutgerinnungskaskade steht, da TF selbst aktiviert werden muss. Seit bekannt ist, dass die im ER lokalisierte Oxidoreduktase PDI TF aktivieren kann, erfolgte in der vorliegenden Arbeit ein umfangreiches Screening an ER-Kandidatenproteinen, um neue TF-Aktivatoren zu charakterisieren. Zunächst konnte gezeigt werden, dass Zelllysate, die eine Vielzahl an unterschiedlichen möglichen Interaktionspartner für TF zu Verfügung stellen, TF direkt aktivieren. Ausgehend davon wurden nun unterschiedliche Kandidaten - zunächst die mit PDI analoge Oxidoreduktase ERp57 - untersucht. Sowohl ERp57 als auch ERp27 konnten TF aktivieren. Da Oxidoreduktasen auch Mitglieder des PLC sind, lag es nahe, auch die weiteren Bestandteile des PLC zu untersuchen. Dabei zeigten sich in der Untersuchung defizienter Zellen für Tapasin, B2M und HLA-A2 verglichen mit retransfizierten bzw. Wildtyp-Zellen jeweils eine statistisch signifikante Hemmung, die durch die Untersuchung mit einem spezifischen anti-TF-Antikörper einen TF-abhängigen Prozess bestätigten. Auch bei der Untersuchung des ERp57-assoziierten Lektins CNX zeigte sich in den Antikörperhemmversuchen eine deutliche Reduktion der TF-Aktivität in der FXa-Bildung. Dies konnte aber nur nach Hemmung der luminalen Domäne von CNX gezeigt werden, nicht aber beim Einsatz eines hemmenden Antikörpers gegen die zytoplasmatische Domäne. Auch eine Untersuchung des löslichen Analogons CRT zeigte keine Effekte. Lediglich in der vergleichenden Untersuchung mit CRT-retransfizierten embryonalen Fibroblasten von der Maus zeigte sich eine Tendenz, dass auch CRT in der FXa-Bildung eine Rolle spielen könnte. Neben den ER-Proteinen wurden auch physikalische Einflüsse auf die TF-Aktivität untersucht, wie sie innerhalb von Wunden beobachtet werden. Dabei zeigte sich, dass erhöhte Temperaturen und ein verminderter pH-Wert die TF-Aktivität steigern bzw. hemmen. Insgesamt zeigte sich, dass es weiterer Untersuchungen bedarf, um die Mechanismen der TF-Aktivierung genauer aufzuklären, damit diese Erkenntnisse auch bei der therapeutischen Anwendung, z.B. zur Vermeidung und Behandlung tiefer Beinvenenthrombosen, eingesetzt werden können.
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Oberndörfer, Florian
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Oberndörfer, Florian (2018): Stimulierung der Faktor Xa-Bildung und Aktivierung von Tissue Factor durch Proteine des endoplasmatischen Retikulums in vitro. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

TF ist zentral bei der Initiierung des Koagulationsprozesses im Rahmen der extrinsischen Blutgerinnung. Vorarbeiten zeigten, dass TF jedoch nicht an der Spitze der Blutgerinnungskaskade steht, da TF selbst aktiviert werden muss. Seit bekannt ist, dass die im ER lokalisierte Oxidoreduktase PDI TF aktivieren kann, erfolgte in der vorliegenden Arbeit ein umfangreiches Screening an ER-Kandidatenproteinen, um neue TF-Aktivatoren zu charakterisieren. Zunächst konnte gezeigt werden, dass Zelllysate, die eine Vielzahl an unterschiedlichen möglichen Interaktionspartner für TF zu Verfügung stellen, TF direkt aktivieren. Ausgehend davon wurden nun unterschiedliche Kandidaten - zunächst die mit PDI analoge Oxidoreduktase ERp57 - untersucht. Sowohl ERp57 als auch ERp27 konnten TF aktivieren. Da Oxidoreduktasen auch Mitglieder des PLC sind, lag es nahe, auch die weiteren Bestandteile des PLC zu untersuchen. Dabei zeigten sich in der Untersuchung defizienter Zellen für Tapasin, B2M und HLA-A2 verglichen mit retransfizierten bzw. Wildtyp-Zellen jeweils eine statistisch signifikante Hemmung, die durch die Untersuchung mit einem spezifischen anti-TF-Antikörper einen TF-abhängigen Prozess bestätigten. Auch bei der Untersuchung des ERp57-assoziierten Lektins CNX zeigte sich in den Antikörperhemmversuchen eine deutliche Reduktion der TF-Aktivität in der FXa-Bildung. Dies konnte aber nur nach Hemmung der luminalen Domäne von CNX gezeigt werden, nicht aber beim Einsatz eines hemmenden Antikörpers gegen die zytoplasmatische Domäne. Auch eine Untersuchung des löslichen Analogons CRT zeigte keine Effekte. Lediglich in der vergleichenden Untersuchung mit CRT-retransfizierten embryonalen Fibroblasten von der Maus zeigte sich eine Tendenz, dass auch CRT in der FXa-Bildung eine Rolle spielen könnte. Neben den ER-Proteinen wurden auch physikalische Einflüsse auf die TF-Aktivität untersucht, wie sie innerhalb von Wunden beobachtet werden. Dabei zeigte sich, dass erhöhte Temperaturen und ein verminderter pH-Wert die TF-Aktivität steigern bzw. hemmen. Insgesamt zeigte sich, dass es weiterer Untersuchungen bedarf, um die Mechanismen der TF-Aktivierung genauer aufzuklären, damit diese Erkenntnisse auch bei der therapeutischen Anwendung, z.B. zur Vermeidung und Behandlung tiefer Beinvenenthrombosen, eingesetzt werden können.