Role of ROS and ROS generating enzymes in the human ovary

Buck, Theresa (2018): Role of ROS and ROS generating enzymes in the human ovary. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Reactive oxygen species (ROS) have long been regarded as destructive molecules that have harmful effects. However, research data emerging over the last decade have demonstrated that ROS can positively influence a range of cellular events in a manner similar to that seen for traditional second messenger molecules. Hydrogen peroxide (H2O2) appears to be the main ROS with such signalling properties, and this molecule has been shown to affect a variety of cellular functions. Its synthesis by the NADPH oxidase (NOX) family of enzymes and how these enzymes are regulated in the human ovary are poorly investigated topics. In the ovary, ROS are involved in fundamental reproductive processes, as implicated by previous studies. However, ROS can also cause oxidative stress, which is associated with impaired oocyte quality and a negative outcome of assisted reproductive techniques. Oocytes grow and mature in ovarian follicles, formed by granulosa cells (GCs) and theca cells (TCs). NOX4, a member of the ROS-producing NOX family, was identified in cultured human in-vitro fertilization (IVF)-derived GCs as well as in corresponding GCs and TCs of growing preantral and antral follicles in human ovarian sections. It was further detected in GC- and TC-derived luteal cells of the corpus luteum. IVF-derived GCs resemble ovulatory GCs and/or the corpus luteum, but do not proliferate. Therefore, as a model for the growing follicle, the granulosa-like tumour cell line KGN was further studied. These cells also express NOX4. Accumulation of ROS in the medium of cultured GCs and KGN could be detected and was inhibited by the specific NOX4 blocker GKT137831. This blocker reduced specifically the production of H2O2 by around 45 % in GCs and KGN. This indicates a major contribution of NOX4 activity to the generation of H2O2. This is a rather long-lived and the only membrane-permeable ROS. H2O2 may diffuse to neighbouring cells, and studies implicated aquaporins in the uptake of extracellular H2O2 into GCs. The gonadotropins follicle stimulating hormone (FSH) and human chorionic gonadotropin (hCG) play a key role in reproduction. They induce the maturation of ovarian follicles, and the ovulation process. FSH and hCG, however, did not alter expression of NOX4, but elevated mRNA expression of antioxidant enzymes including catalase. This indicates a role of these hormones in ovarian ROS homeostasis. H2O2 and FSH also increased MAPK-phosphorylation, suggesting convergence of the signalling pathways. Furthermore, H2O2, when added to GCs, elevated several cytokines. This implicates H2O2 in inflammatory events, which are possibly involved in ovulation and/or regression of the corpus luteum. Inhibition of H2O2 production by GKT137831 did not affect cell viability of GCs but lowered expression of CYP11A1, a crucial enzyme for steroid synthesis. This suggests involvement in the maintenance of the steroidogenic phenotype of GCs. In proliferating KGN cells, GKT137831 reduced cell growth. This may implicate a role of H2O2 in cell proliferation and possibly in follicular growth. Taken together, the results imply important roles of H2O2 in the regulation of GCs. As ROS are potentially harmful molecules, the full elucidation of the two sides of the ROS-signalling system in the human ovary is important to guide future therapeutic strategies.

Abstract

Reaktive Sauerstoffspezies (englisch reactive oxygen species, ROS) wurden lange Zeit als potentiell schädliche Moleküle betrachtet, die nachteilige Effekte haben. Forschungsdaten des letzten Jahrzehnts zeigen jedoch, dass ROS eine Reihe von zellulären Ereignissen positiv beeinflussen können, ähnlich wie traditionelle Second Messenger Moleküle. Wasserstoffperoxid (H2O2) scheint das wichtigste ROS mit einer solchen Signaleigenschaft zu sein. Es wurde beobachtet, dass dieses Molekül eine Vielfalt von zellulären Funktionen beeinflusst. Seine Synthese durch die Enzymfamilie NADPH Oxidasen (NOX) und dessen Regulierung im menschlichen Ovar sind kaum erforschte Themen. ROS sind im Ovar in fundamentalen Reproduktionsprozessen involviert, was frühere Studien implizieren. Allerdings können ROS auch oxidativen Stress verursachen, welcher mit schlechter Oozytenqualität und negativem Ergebnis bei assistierten Reproduktionstechniken verbunden ist. Oozyten wachsen und reifen in ovariellen Follikeln, welche aus Granulosazellen (GZs) und Thekazellen (TZs) gebildet werden. NOX4 ist ein Mitglied der ROS-produzierenden NOX Familie und wurde sowohl in kultivierten menschlichen GZs, die aus In-Vitro-Fertilisation (IVF) stammen, als auch in den korrespondierenden GZs und TZs von wachsenden Preantral- und Antralfollikeln in menschlichen Ovarschnitten identifiziert. Des Weiteren wurde es in Lutealzellen des Gelbkörpers, welche aus den GZs und TZs hervorgehen, festgestellt. IVF-abstammende GZs ähneln den ovulatorischen GZs und/oder dem Gelbkörper, aber proliferieren nicht. Deshalb wurde zusätzlich die Granulosa-ähnliche Tumorzelllinie KGN als weiteres Model für den wachsenden Follikel untersucht. Diese Zellen exprimieren auch NOX4. Die Akkumulation von ROS im Medium durch kultivierte GZs und KGN konnte ermittelt werden und wurde von einem spezifischen NOX4 Blocker GKT137831 gehemmt. Dieser Blocker reduzierte spezifisch die H2O2-Produktion um 45 % in GZs und KGN, was auf einen erheblichen Beitrag der NOX4-Aktivität an der H2O2-Produktion hinweist. Dies ist vielmehr ein langlebiges und das einzig membran-permeable ROS. H2O2 könnte zu Nachbarzellen diffundieren und Studien weisen auf eine Aufnahme von extrazellulärem H2O2 in GZs hin, an welcher Aquaporine beteiligt sind. Die Gonadotropine, follikelstimulierendes Hormon (FSH) und humanes Choriongonadotropin (hCG), spielen eine Schlüsselrolle in der Reproduktion. Sie induzieren die Reifung von ovariellen Follikeln und den Eisprung. FSH und hCG veränderten jedoch nicht die Expression von NOX4, aber erhöhten die Expression von antioxidativen Enzymen, einschließlich der Katalase. Dies weist auf einen Einfluss dieser Hormone auf die ovarielle ROS-Homöostase hin. H2O2 und FSH erhöhten auch die MAPK-Phosphorylierung, was auf eine Konvergenz der Signalwege hinweist. Zusätzlich erhöhte H2O2 nach Zugabe zu den GZs einige Zytokine. Dies bringt H2O2 mit inflammatorischen Ereignissen in Verbindung, welche möglicherweise beim Eisprung und/oder dem Abbau des Gelbkörpers beteiligt sind. Die Hemmung der H2O2-Produktion durch GKT137831 zeigte keinen Einfluss auf die Zellviabilität, aber senkte die Expression von CYP11A1, ein zentrales Enzym der Steroidsynthese. Dies deutet auf eine Beteiligung des Erhalts des steroidogenen Phänotyps der GZs hin. In proliferierenden KGN Zellen reduzierte GKT137831 das Zellwachstum. Dies könnte eine Rolle von H2O2 in der Zellproliferation und möglicherweise im Follikelwachstum implizieren. Die Ergebnisse dieser Studie deuten zusammenfassend auf eine wichtige Signalrolle von H2O2 in der Regulierung der GZs hin. Da ROS potenziell schädliche Moleküle sind, ist die vollständige Aufklärung der gegensätzlichen Seiten des ROS-signalisierenden Systems im menschlichen Ovar wichtig, um zukünftige therapeutische Ansätze zu entwickeln.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 18. September 2018
• 1. Bericht­erstatter:in: Kunz, Lars