Microglial phagocytosis of amyloid plaques in an ex vivo model of Alzheimer's Disease

Daria, Anna (2018): Microglial phagocytosis of amyloid plaques in an ex vivo model of Alzheimer's Disease. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is one of the most severe neurodegenerative disorders defined by deposition of amyloid plaques and neurofibrillary tangles. An important role in AD is also exerted by neuroinflammation and microglial activation is one of the hallmarks of the disease pathology. Although microglia are known to be recruited and to cluster around amyloid plaques in the AD brain, their involvement in amyloid plaque clearance over the course of AD is still controversial. Impaired microglial function resulting in decreased Aβ clearance was reported in sporadic AD cases as well as in mouse models of AD. Moreover, several recently identified genetic risk alleles for AD have been linked to microglial function and phagocytosis. To study the contribution of microglial phagocytosis in amyloid plaque clearance, I established a novel ex vivo co-culture model where I combined organotypic brain slices from aged, amyloid plaque-bearing mice (APPPS1) together with slices from young, neonatal wild-type (WT) mice. In the ex vivo co-culture model, I observed changes in amyloid plaque morphology over 14 days in vitro manifested by clearance of the plaque halo bearing diffuse Aβ and increased number of core-only plaques. Additionally, I found a strong increase in immunoreactivity of CD68, a lysosomal marker of activated microglia/macrophages in the old APPPS1 tissue. Specific recruitment and clustering of CD68 positive cells around amyloid plaques was paralleled by a decrease in plaque size upon co-culturing of old and young brain slices. Pharmacological inhibition of phagocytosis by cytochalasin D prevented clearance of the plaque halo, suggesting that CD68 positive microglial cells detected at amyloid plaques are phagocytosing Aβ. Furthermore, specific removal of either old or young microglial cells by clodronate hindered amyloid plaque clearance, suggesting a synergistic contribution of both microglial populations in plaque phagocytosis. To discriminate between young and old microglial cells, I co-cultured either young slices from CX3CR1+/GFP reporter mice with old APPPS1 brain slices or old APPPS1/CX3CR1+/GFP brain slices together with young WT slices. Surprisingly, only the old APPPS1 microglial cells were found in the vicinity of amyloid plaques and thus identified as cells responsible for Aβ uptake in our ex vivo co-culture model. Intriguingly, culturing old APPPS1 brain slices in conditioned media collected from young WT brain slices or from cultured young primary microglia was sufficient to increase amyloid plaque clearance, in contrast to media obtained from microglia-depleted young slices. These data suggested that soluble factors released by young microglia promote Aβ uptake by the old APPPS1 microglial cells. Hence, I tested action of several pro- and anti-inflammatory cytokines on amyloid plaque clearance and found enhanced plaque phagocytosis upon direct addition of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) to old APPPS1 brain slices, mimicking the co-culture condition. Moreover, the GM-CSF treatment increased numbers of CD68 positive cells confirming its mitogenic potential on myeloid cells. Increased numbers of proliferating microglial were also detected upon co-culturing of old and young brain slices. Nevertheless, co-culturing of young slices from GM-CSF-/- mice with old APPPS1 brain slices still resulted in increased numbers of core-only plaques and, accordingly, increased CD68 coverage. Therefore, GM-CSF is not the sole factor triggering microglial proliferation and Aβ uptake in the ex vivo co-culture model. However, proliferation of old microglial cells was necessary for amyloid plaque clearance, as exposure of the old APPPS1 tissue to the young WT conditioned media obtained after treatment with the proliferative inhibitor AraC prevented amyloid plaque clearance. This study suggests that impaired amyloid plaque clearance of aged microglia in AD may be reversed and microglial phagocytic capacity may be restored upon a proper stimulus. The novel ex vivo model system can be used as a platform to screen, test and identify factors or compounds directed to therapeutically modulate phagocytic competence of microglia.

Abstract

Die Alzheimer’sche Krankheit (Alzheimer’s disease, AD) oder kurz Alzheimer ist eine der schwerwiegendsten neurodegenerativen Erkrankungen und zeichnet sich durch die Ablagerungen von amyloiden Plaques und neurofibrillären Bündeln aus. Eine wichtige Rolle in Alzheimer spielt zudem die Neuroinflammation, die sich pathologisch unter anderem durch die Aktivierung von Mikroglia-Zellen kennzeichnet. Obwohl bereits bekannt ist, dass Mikroglia im Alzheimer-Gehirn rekrutiert werden und sich an den amyloiden Plaques sammeln, bleibt ihre genaue Beteiligung an der Entfernung der Plaques im Zusammenhang mit Alzheimer kontrovers. In Fällen der sporadischen Form von Alzheimer sowie in Mausmodellen konnten mikrogliale Defekte gezeigt werden, die zu einem geringeren Aβ Abbau führen. Darüber hinaus wurden mehrere kürzlich identifizierte genetische Risiko-Allele für Alzheimer mit der mikroglialen Funktion und Phagozytose in Verbindung gebracht. Um die Beteiligung der mikroglialen Phagozytose an der Beseitigung der amyloiden Plaques zu untersuchen, habe ich ein neues ex vivo Ko-Kulturenmodell etabliert, bei dem ich organotypische Gehirnschnitte von gealterten, amyloid Plaque positiven Mäusen (APPPS1) mit Hirnschnitten von jungen, neonatalen Wildtyp-Mäusen (WT) kombiniert habe. In diesem ex vivo Ko-Kulturenmodell konnte ich innerhalb von 14 Tagen Veränderungen in der Morphologie der amyloiden Plaques beobachten, nämlich die Höfe diffuser Aβ Plaques wurden zu einem Kern tragendem (core-only) Plaque abgebaut. Weiterhin konnte ich einen starken Anstieg in der Immunreaktivität von CD68, einem lysosomalen Marker aktivierter Mikroglia und Makrophagen, im Gewebe der alten APPPS1 Mäuse beobachten. Die spezifische Rekrutierung und Ansammlung von CD68-positiven Zellen um amyloide Plaques verlief parallel zur Reduktion der Plaque-Größe während der Ko-Kultivierung von alten und jungen Gehirnschnitten. Die pharmakologische Inhibition der Phagozytose mit Cytochalasin D verhinderte den Abbau des Plaque-Hofs und liefert somit den Hinweis, dass CD68-positive Mikroglia, welche an den amyloiden Plaques detektiert wurden, Aβ phagozytieren. Überdies konnte der Abbau von amyloiden Plaques spezifisch durch die Entfernung der alten oder jungen Mikroglia mittels Clodronat verhindert werden, was auf eine synergetische Beteiligung beider Mikroglia-Populationen an der Phagozytose weist. Um die jungen und alten Mikroglia-Zellen voneinander unterscheiden zu können, wurden entweder junge Schnitte aus CX3CR1+/GFP –Reportermäusen mit alten APPPS1 Hirnschnitten oder alte APPPS1/CX3CR1+/GFP –Gehirnschnitte mit jungen Wildtyp-Schnitten kultiviert. Überraschenderweise wurden nur die Mikroglia-Zellen der alten APPPS1-Mäuse in der direkten Umgebung der amyloiden Plaques gefunden und somit als die für die Aβ-Aufnahme verantwortlichen Zellen in unserem ex vivo Ko-Kulturenmodell identifiziert. Interessanterweise war die Kultivierung alter APPPS1 Hirnschnitte in Medium, das von jungen WT Hirnschnitten oder von jungen, primären Mikroglia gesammelt wurde, ausreichend, um den Abbau der amyloiden Plaques zu erhöhen. Dies war nicht der Fall für Medium von jungen Hirnschnitten, bei dem die Mikroglia zuvor entfernt wurden. Diese Daten zeigen, dass die jungen Mikroglia lösliche Faktoren abgeben und die Aβ Aufnahme der alten APPPS1 Mikroglia begünstigen. Infolgedessen habe ich verschiedene pro- und anti-inflammatorische Cytokine auf den Abbau der amyloiden Plaques getestet und konnte zeigen, dass die Phagozytose der Plaques nach direkter Zugabe des Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) zu den alten APPPS1 Hirnschnitten erhöht war und so die Bedingungen der Ko-Kultur nachgeahmt werden konnten. Ferner erhöhte die GM-CSF Behandlung die Anzahl CD68-positiver Zellen und bestätigt so sein mitogenes Potential auf myeloide Zellen. Überdies konnte in den Ko-Kulturen alter und junger Hirnschnitte eine ansteigende Anzahl proliferierender Mikroglia detektiert werden. Dennoch resultierte die Ko-Kultivierung junger Hirnschnitte von GM-CSF-/- Mäusen mit alten APPPS1 Hirnschnitten in einer erhöhten Anzahl reiner Kern-Plaques (core-only) und dementsprechend einer höheren Menge von CD68. Folglich ist GM-CSF nicht der einzige Faktor in dem ex vivo Ko-Kulturen Modell, der die Mikroglia Proliferation und die Aβ Aufnahme auslöst. Die Proliferation alter Mikroglia-Zellen war für die Entfernung der amyloiden Plaques jedoch nötig, da die Exposition des alten APPPS1 Gewebes mit Medium von jungen WT Schnitten nach Behandlung durch den Proliferations-Inhibitor AraC verhindert wurde. Diese Studie konnte zeigen, dass der verminderte Abbau von amyloiden Plaques durch gealterte Mikroglia in der Alzheimer Krankheit rückgängig gemacht werden und die mikrogliale Phagozytosekapazität durch einen geeigneten Stimulus wiederhergestellt werden kann. Das neue ex vivo Modellsystem kann hierbei als Plattform dienen, Faktoren oder Präparate zu identifizieren, zu selektieren und zu testen, um therapeutisch die Phagozytosekompetenz der Mikroglia zu modulieren.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Alzheimer's Disease, microglia, phagocytosis, amyloid plaques, ex vivo model
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 1. August 2018
• 1. Bericht­erstatter:in: Haass, Christian