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Bildgebende Massenspektrometrie zur pharmakokinetischen in situ Analyse von Kinaseinhibitoren in Tumorgeweben
Bildgebende Massenspektrometrie zur pharmakokinetischen in situ Analyse von Kinaseinhibitoren in Tumorgeweben
Das zentrale Thema dieser Doktorarbeit ist die Etablierung und Anwendung von Methoden der bildgebenden Massenspektrometrie zur pharmakokinetischen in situ Analyse von Kinaseinhibitoren in Tumorgeweben. Der erste Artikel, der im Rahmen dieser Doktorarbeit veröffentlicht wurde, “A rapid ex vivo tissue model for optimising drug detection and ionisation in MALDI imaging studies”, publiziert in Histochemistry and Cell Biology, behandelt die Etablierung eines ex vivo Modells, um die Ionisierbarkeit und die Detektierbarkeit von in vivo verabreichten Wirkstoffen mittels bildgebender Massenspektrometrie vorherzusagen. Hierbei wurden Verdünnungsreihen der Wirkstoffe Afatinib, Erlotinib, Sorafenib und Pirfenidon auf Leberschnitte aufgebracht. Mithilfe dieser ex vivo behandelten Leberschnitte wurden Probenvorbereitung und Messparameter für den Wirkstoffnachweis optimiert. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse wurden anschließend in einem MALDI imaging Ansatz an in vivo behandelten Lebergeweben validiert. Anhand des ex vivo Experiments konnten Matrixzusammensetzung sowie Messparameter für den jeweiligen Wirkstoffnachweis optimiert werden. Diese Etablierungsmethode kann nun vor dem Einsatz von Labortieren durchgeführt werden und eine Vorhersage für die Messbarkeit von Wirkstoffen in Gewebe liefern. In der zweiten Studie “A novel approach of MALDI drug imaging, immunohistochemistry, and digital image analysis for drug distribution studies in tissues”, erschienen in Analytical Chemistry, wurde die bildgebende Massenspektrometrie zur Untersuchung der Verteilung und Kinetik von Wirkstoffen in Xenograft Tumoren herangezogen. Es wurden zwei Tumormodelle untersucht, ein Xenograft Modell für Kopf-Hals-Tumoren, in dem die Tyrosinkinaseinhibitoren Afatinib und Erlotinib eingesetzt wurden, sowie ein Xenograft Modell für Sarkome mit dem Multikinaseinhibitor Sorafenib. Die Wirkstoffverteilung in den Gewebeschnitten wurde mittels MALDI imaging bestimmt. Diese beiden Befunde, Wirkstoffverteilung und Gefäß-Färbung, wurden koregistriert und mittels digitaler Bildanalyse ausgewertet. Diese multimodale Vorgehensweise ermöglichte die Erfassung des Zusammenhangs von Vaskularisierung und Wirkstoffverteilung in den Xenograft Tumoren. Neben der heterogenen Wirkstoffverteilung, die in allen Behandlungsregimen zu detektieren waren, war in den Tumorregionen, in denen starke Wirkstoffsignale gemessen wurden, ein hoher Grad an Vaskularisierung auffällig. Im Gegensatz dazu konnten in den Tumorregionen ohne Wirkstoffsignale nur wenige Blutgefäße gefunden werden. Im Sarkommodell wurde ein Zusammenhang zwischen der Größe der Blutgefäße und der Wirkstoffverteilung festgestellt. Der Flächenanteil von kleinen Gefäßen am Gesamtflächenanteil der Blutgefäße war in den stark wirkstoffhaltigen Tumorregionen größer als in den Regionen ohne Wirkstoff, was auf eine überwiegende Diffusion durch die Endothelien der kleinen Blutgefäße hinweist. Um die Diffusion in das Tumorgewebe zu untersuchen, wurde die Signalintensität der Wirkstoffmessung in Abhängigkeit von der Entfernung zum nächsten Blutgefäß verglichen. In diesem Zusammenhang wurden signifikante Unterschiede der Diffusion zwischen den einzelnen Wirkstoffen und zwischen verschiedenen Dosierungen erkannt. Die Kombination aus Wirkstoffnachweis mit MALDI imaging und Immunhistochemie ist ein spezifischer und örtlich hochaufgelöster Ansatz, der die Korrelation von histologischen Merkmalen mit pharmakokinetischen Eigenschaften erlaubt und so wertvolle Informationen für die Weiterentwicklung von Wirkstoffen, Formulierungen und Behandlungsschemata liefert., The main focus of this thesis is the development and application of mass spectrometry imaging for the pharmacokinetic in situ analysis of kinase inhibitors in tumour tissues. The first publication reported in this thesis, “A rapid ex vivo tissue model for optimising drug detection and ionisation in MALDI imaging studies”, published in Histochemistry and Cell Biology, addresses the development of a reliable ex vivo model which enables the prediction of ionisation and the detection of in vivo administered drug molecules. Decreasing dilution series of afatinib, erlotinib, sorafenib and pirfenidone were spotted onto liver sections in order to specifically optimise sample preparation and measurement conditions for the subsequent drug detection. The results from the ex vivo liver spotting model were validated by a MALDI drug imaging approach of in vivo treated liver tissue. Using the developed ex vivo experiment, it was possible to establish a protocol for sample preparation, by finding an optimal matrix substance for each drug, and to improve measurement conditions, by finding a suitable mass spectrometer for a specific drug detection. These method optimisation experiments should be carried out prior to the treatment of animals and therefore help to reduce animal experiments by predicting the measurability of drugs in a tissue background. In the second publication, “A novel approach of MALDI drug imaging, immunohistochemistry, and digital image analysis for drug distribution studies in tissues”, published in Analytical Chemistry, imaging mass spectrometry was employed for the examination of drug distribution and kinetics in xenograft tumour tissues. Two tumor models were investigated, a head and neck squamous cell carcinoma xenograft model, treated with the tyrosine kinase inhibitors erlotinib and afatinib, and a sarcoma xenograft model, treated with the multi-kinase inhibitor sorafenib. After the analysis of drug distribution by imaging mass spectrometry, the tumor tissue was immunostained for CD31, a marker for blood vessels. Subsequently, both images, the drug distribution revealed by MALDI imaging and the CD31 immunostain, were co-registered and examined by digital image analysis. This combined approach allowed a correlation of the drug distribution with the occurence, size and distance of blood vessels. Despite a heterogeneous distribution of all three anti-cancer agents, we found a higher degree of vascularization in the tumor regions with high drug levels, compared to regions without drug signals that contained only few blood vessels. In the sarcoma model, we found a correlation between blood vessel size and drug distribution. The ratio between small vessels to total vessel areas in drug containing tumor regions was significantly higher than in tumor regions without drug signal, suggesting a prevailing diffusion through the endothelia of small blood vessels. The drug signal intensity as a function of distance to blood vessels was measured in order to investigate the diffusion of the drug into the tumor tissue. As a result, significant differences in the diffusion states were detected between the anti-cancer agents and between varying doses. The combination of drug detection by MALDI imaging and immunohistochemistry appeared to be a specific approach with high local resolution which enables the correlation of histological features with pharmacokinetic properties. It is therefore a valuable tool for the improvement of drug design, administration formula or treatment regimen.
MALDI imaging, mass spectrometry, immunohistochemistry, pharmacokinetics drug, development
Huber, Katharina
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Huber, Katharina (2018): Bildgebende Massenspektrometrie zur pharmakokinetischen in situ Analyse von Kinaseinhibitoren in Tumorgeweben. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Das zentrale Thema dieser Doktorarbeit ist die Etablierung und Anwendung von Methoden der bildgebenden Massenspektrometrie zur pharmakokinetischen in situ Analyse von Kinaseinhibitoren in Tumorgeweben. Der erste Artikel, der im Rahmen dieser Doktorarbeit veröffentlicht wurde, “A rapid ex vivo tissue model for optimising drug detection and ionisation in MALDI imaging studies”, publiziert in Histochemistry and Cell Biology, behandelt die Etablierung eines ex vivo Modells, um die Ionisierbarkeit und die Detektierbarkeit von in vivo verabreichten Wirkstoffen mittels bildgebender Massenspektrometrie vorherzusagen. Hierbei wurden Verdünnungsreihen der Wirkstoffe Afatinib, Erlotinib, Sorafenib und Pirfenidon auf Leberschnitte aufgebracht. Mithilfe dieser ex vivo behandelten Leberschnitte wurden Probenvorbereitung und Messparameter für den Wirkstoffnachweis optimiert. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse wurden anschließend in einem MALDI imaging Ansatz an in vivo behandelten Lebergeweben validiert. Anhand des ex vivo Experiments konnten Matrixzusammensetzung sowie Messparameter für den jeweiligen Wirkstoffnachweis optimiert werden. Diese Etablierungsmethode kann nun vor dem Einsatz von Labortieren durchgeführt werden und eine Vorhersage für die Messbarkeit von Wirkstoffen in Gewebe liefern. In der zweiten Studie “A novel approach of MALDI drug imaging, immunohistochemistry, and digital image analysis for drug distribution studies in tissues”, erschienen in Analytical Chemistry, wurde die bildgebende Massenspektrometrie zur Untersuchung der Verteilung und Kinetik von Wirkstoffen in Xenograft Tumoren herangezogen. Es wurden zwei Tumormodelle untersucht, ein Xenograft Modell für Kopf-Hals-Tumoren, in dem die Tyrosinkinaseinhibitoren Afatinib und Erlotinib eingesetzt wurden, sowie ein Xenograft Modell für Sarkome mit dem Multikinaseinhibitor Sorafenib. Die Wirkstoffverteilung in den Gewebeschnitten wurde mittels MALDI imaging bestimmt. Diese beiden Befunde, Wirkstoffverteilung und Gefäß-Färbung, wurden koregistriert und mittels digitaler Bildanalyse ausgewertet. Diese multimodale Vorgehensweise ermöglichte die Erfassung des Zusammenhangs von Vaskularisierung und Wirkstoffverteilung in den Xenograft Tumoren. Neben der heterogenen Wirkstoffverteilung, die in allen Behandlungsregimen zu detektieren waren, war in den Tumorregionen, in denen starke Wirkstoffsignale gemessen wurden, ein hoher Grad an Vaskularisierung auffällig. Im Gegensatz dazu konnten in den Tumorregionen ohne Wirkstoffsignale nur wenige Blutgefäße gefunden werden. Im Sarkommodell wurde ein Zusammenhang zwischen der Größe der Blutgefäße und der Wirkstoffverteilung festgestellt. Der Flächenanteil von kleinen Gefäßen am Gesamtflächenanteil der Blutgefäße war in den stark wirkstoffhaltigen Tumorregionen größer als in den Regionen ohne Wirkstoff, was auf eine überwiegende Diffusion durch die Endothelien der kleinen Blutgefäße hinweist. Um die Diffusion in das Tumorgewebe zu untersuchen, wurde die Signalintensität der Wirkstoffmessung in Abhängigkeit von der Entfernung zum nächsten Blutgefäß verglichen. In diesem Zusammenhang wurden signifikante Unterschiede der Diffusion zwischen den einzelnen Wirkstoffen und zwischen verschiedenen Dosierungen erkannt. Die Kombination aus Wirkstoffnachweis mit MALDI imaging und Immunhistochemie ist ein spezifischer und örtlich hochaufgelöster Ansatz, der die Korrelation von histologischen Merkmalen mit pharmakokinetischen Eigenschaften erlaubt und so wertvolle Informationen für die Weiterentwicklung von Wirkstoffen, Formulierungen und Behandlungsschemata liefert.

Abstract

The main focus of this thesis is the development and application of mass spectrometry imaging for the pharmacokinetic in situ analysis of kinase inhibitors in tumour tissues. The first publication reported in this thesis, “A rapid ex vivo tissue model for optimising drug detection and ionisation in MALDI imaging studies”, published in Histochemistry and Cell Biology, addresses the development of a reliable ex vivo model which enables the prediction of ionisation and the detection of in vivo administered drug molecules. Decreasing dilution series of afatinib, erlotinib, sorafenib and pirfenidone were spotted onto liver sections in order to specifically optimise sample preparation and measurement conditions for the subsequent drug detection. The results from the ex vivo liver spotting model were validated by a MALDI drug imaging approach of in vivo treated liver tissue. Using the developed ex vivo experiment, it was possible to establish a protocol for sample preparation, by finding an optimal matrix substance for each drug, and to improve measurement conditions, by finding a suitable mass spectrometer for a specific drug detection. These method optimisation experiments should be carried out prior to the treatment of animals and therefore help to reduce animal experiments by predicting the measurability of drugs in a tissue background. In the second publication, “A novel approach of MALDI drug imaging, immunohistochemistry, and digital image analysis for drug distribution studies in tissues”, published in Analytical Chemistry, imaging mass spectrometry was employed for the examination of drug distribution and kinetics in xenograft tumour tissues. Two tumor models were investigated, a head and neck squamous cell carcinoma xenograft model, treated with the tyrosine kinase inhibitors erlotinib and afatinib, and a sarcoma xenograft model, treated with the multi-kinase inhibitor sorafenib. After the analysis of drug distribution by imaging mass spectrometry, the tumor tissue was immunostained for CD31, a marker for blood vessels. Subsequently, both images, the drug distribution revealed by MALDI imaging and the CD31 immunostain, were co-registered and examined by digital image analysis. This combined approach allowed a correlation of the drug distribution with the occurence, size and distance of blood vessels. Despite a heterogeneous distribution of all three anti-cancer agents, we found a higher degree of vascularization in the tumor regions with high drug levels, compared to regions without drug signals that contained only few blood vessels. In the sarcoma model, we found a correlation between blood vessel size and drug distribution. The ratio between small vessels to total vessel areas in drug containing tumor regions was significantly higher than in tumor regions without drug signal, suggesting a prevailing diffusion through the endothelia of small blood vessels. The drug signal intensity as a function of distance to blood vessels was measured in order to investigate the diffusion of the drug into the tumor tissue. As a result, significant differences in the diffusion states were detected between the anti-cancer agents and between varying doses. The combination of drug detection by MALDI imaging and immunohistochemistry appeared to be a specific approach with high local resolution which enables the correlation of histological features with pharmacokinetic properties. It is therefore a valuable tool for the improvement of drug design, administration formula or treatment regimen.