Logo Logo
Help
Contact
Switch language to German
Quantification of biomolecular binding dynamics by Fluorescence Correlation Spectroscopy
Quantification of biomolecular binding dynamics by Fluorescence Correlation Spectroscopy
Diffusion and molecular binding processes are indispensable for biological systems. A vital step towards the understanding of such dynamics and their interplay is a thorough quantification of all parameters involved. This work addresses the characterization of biomolecular diffusion and binding dynamics using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). To quantify the reversible surface attachment of fluorescently labeled molecules, a novel method termed surface-integrated FCS (SI-FCS) is developed. Using this technique, the association and dissociation rates of receptor-ligand pairs can be determined over a wide range of time scales, ranging from hundreds of milliseconds to tens of seconds. The surface of interest is exposed to a widefield illumination and a highly sensitive electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera is used for detection, not only providing single-molecule sensitivity, but also enabling a parallel detection of the signal, which facilitates multiplexed SI-FCS measurements across the field of view. To validate this approach, we quantify the reversible hybridization of single-stranded deoxyribonucleic acid (DNA) using a standard total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope. The nucleotide overlap was systematically varied to demonstrate the sensitivity of SI-FCS. Furthermore, this work extensively employs FCS in its more conventional form using a confocal microscope. The effect of refractive index mismatches on single-focus FCS measurements is thoroughly characterized and a regime in which unbiased experiments are possible is identified. Confocal FCS is used to monitor the filament formation of FtsZ proteins (filamenting temperature-sensitive mutant Z) and their breakage by the protein MipZ in vitro. Potential artifacts are identified and a novel model to analyze diffusing filaments in FCS experiments is derived, applied, and validated. These findings not only demonstrate that filament formation can be efficiently studied using confocal FCS, but also indicate that FtsZ from Caulobacter crescentus may intrinsically form small oligomers. Finally, this work characterizes the diffusion of biomolecules in lipid monolayers at the air-water interface using confocal FCS. A miniaturized fixed area-chamber, which requires only minute amounts of protein, is presented and validated. Using this design, monolayer experiments become accessible to studies where biomolecules can only be purified in small amounts. Moreover, the quantification of diffusion in monolayers using FCS is a major step towards the routine characterization of binding of biomolecules to lipid monolayers., Diffusion und molekulare Bindungsreaktionen sind elementare Prozesse in biologischen Systemen. Für das Verständnis solcher Dynamiken und deren Wechselwirkungen ist es letztlich unabdingbar die beteiligten Parameter exakt zu quantifizieren. Diesem Ziel folgend setzt sich diese Arbeit mit der Quantifizierung von Diffusions- und Bindungsdynamiken unter Nutzung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) auseinander. Um die Assoziations- und Dissoziationsraten von reversiblen Bindungsreaktionen an Oberflächen zu messen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neuartige Methode namens "surface-integrated FCS" (SI-FCS) entwickelt. Mittels dieser Methode können Bindungsraten zwischen Rezeptoren und fluoreszierenden Liganden in Zeitbereichen von Millisekunden bis über einer Minute gemessen werden. Die zu untersuchende Oberfläche, an der die Bindungsreaktionen stattfinden, wird mit einer Weitfeldausleuchtung beschienen und die daraufhin emittierte Fluoreszenz von den Liganden wird mit einer sehr empfindlichen Kamera (electron-multiplying charge-coupled device) detektiert. Diese Flächendetektion verfügt nicht nur über ausreichende Empfindlichkeit um einzelne Moleküle zu detektieren, sondern ermöglicht auch die parallele Messung mehrerer Autokorrelationskurven im Sichtfeld. Zur Validierung dieses neuartigen Ansatzes wird die reversible Hybridisierung von Desoxyribonukleinsäuren (DNS) mit einem im Rahmen dieser Arbeit konstruierten totalreflexionsbasiertem Fluoreszenzmikroskop (TIRF Mikroskop) quantifiziert. Die Anzahl der hybridisierenden Basenpaare wird in dieser Studie systematisch variiert und drückt sich in klaren Änderungen der gemessenen Bindungsraten aus. Damit wird die Sensitivität der Methode unterstrichen. Darüber hinaus bedient sich diese Arbeit der konventionellen konfokalen FCS. Das Problem von Proben, die einen anderen Brechungsindex als den von Wasser aufweisen, wird intensiv im Kontext von FCS Messungen beleuchtet. Abschließend werden Messbedingungen aufgezeigt unter denen systematische Messfehler und Artefakte, die auf den Brechungsindex zurückzuführen sind, vermieden werden können. In einem Teil dieser Arbeit wird die konfokale FCS genutzt um die Polymerisation von FtsZ Proteinen (Filamenting Temperature-Sensitive Z), sowie deren Zerlegung durch das Protein MipZ, zu untersuchen. Potentielle Fehlerquellen solcher Messungen werden beleuchtet und ein neues Modell für die Analyse von konfokalen FCS Messungen an Filamenten wird hergeleitet. Die präsentierten Ergebnisse zeigen nicht nur, dass FCS eine geeignete Methode ist umWachstum und Zerfall von Filamenten im Allgemeinen zu charakterisieren, sondern liefern auch deutliche Hinweise, dass FtsZ aus dem Bakterium Caulobacter crescentus auch in Abwesenheit von Guanosintriphosphat (GTP) kurze Oligomere bildet. Letzteres ist insbesondere interessant, da typischerweise angenommen wird, dass FtsZ als monomeres Protein vorliegt und erst in Anwesenheit von GTP zu Filamenten polymerisiert. Abschließend quantifiziert diese Arbeit die Diffusion von Biomolekülen in Lipidmonoschichten an der Grenzfläche zwischen Luft und Wasser. Unter Verwendung der konfokalen FCS werden Messungen in Miniaturkammern durchgeführt und validiert. Mithilfe dieser Methode werden Messungen an Biomolekülen ermöglicht, die nur in sehr geringen Mengen aufgereinigt werden können. Die hier präsentierten Diffusionsmessungen stellen einen wichtigen Schritt hin zur FCS basierten Charakterisierung der Bindungskinetiken von Biomolekülen zu Lipidmonoschichten dar.
Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), binding kinetics, lipid monolayers, filamenting temperature-sensitive mutant Z (FtsZ), refractive index mismatch
Mücksch, Jonas Peter
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Mücksch, Jonas Peter (2018): Quantification of biomolecular binding dynamics by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
[img]
Preview
PDF
Muecksch_Jonas_P.pdf

48MB

Abstract

Diffusion and molecular binding processes are indispensable for biological systems. A vital step towards the understanding of such dynamics and their interplay is a thorough quantification of all parameters involved. This work addresses the characterization of biomolecular diffusion and binding dynamics using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). To quantify the reversible surface attachment of fluorescently labeled molecules, a novel method termed surface-integrated FCS (SI-FCS) is developed. Using this technique, the association and dissociation rates of receptor-ligand pairs can be determined over a wide range of time scales, ranging from hundreds of milliseconds to tens of seconds. The surface of interest is exposed to a widefield illumination and a highly sensitive electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera is used for detection, not only providing single-molecule sensitivity, but also enabling a parallel detection of the signal, which facilitates multiplexed SI-FCS measurements across the field of view. To validate this approach, we quantify the reversible hybridization of single-stranded deoxyribonucleic acid (DNA) using a standard total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope. The nucleotide overlap was systematically varied to demonstrate the sensitivity of SI-FCS. Furthermore, this work extensively employs FCS in its more conventional form using a confocal microscope. The effect of refractive index mismatches on single-focus FCS measurements is thoroughly characterized and a regime in which unbiased experiments are possible is identified. Confocal FCS is used to monitor the filament formation of FtsZ proteins (filamenting temperature-sensitive mutant Z) and their breakage by the protein MipZ in vitro. Potential artifacts are identified and a novel model to analyze diffusing filaments in FCS experiments is derived, applied, and validated. These findings not only demonstrate that filament formation can be efficiently studied using confocal FCS, but also indicate that FtsZ from Caulobacter crescentus may intrinsically form small oligomers. Finally, this work characterizes the diffusion of biomolecules in lipid monolayers at the air-water interface using confocal FCS. A miniaturized fixed area-chamber, which requires only minute amounts of protein, is presented and validated. Using this design, monolayer experiments become accessible to studies where biomolecules can only be purified in small amounts. Moreover, the quantification of diffusion in monolayers using FCS is a major step towards the routine characterization of binding of biomolecules to lipid monolayers.

Abstract

Diffusion und molekulare Bindungsreaktionen sind elementare Prozesse in biologischen Systemen. Für das Verständnis solcher Dynamiken und deren Wechselwirkungen ist es letztlich unabdingbar die beteiligten Parameter exakt zu quantifizieren. Diesem Ziel folgend setzt sich diese Arbeit mit der Quantifizierung von Diffusions- und Bindungsdynamiken unter Nutzung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) auseinander. Um die Assoziations- und Dissoziationsraten von reversiblen Bindungsreaktionen an Oberflächen zu messen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neuartige Methode namens "surface-integrated FCS" (SI-FCS) entwickelt. Mittels dieser Methode können Bindungsraten zwischen Rezeptoren und fluoreszierenden Liganden in Zeitbereichen von Millisekunden bis über einer Minute gemessen werden. Die zu untersuchende Oberfläche, an der die Bindungsreaktionen stattfinden, wird mit einer Weitfeldausleuchtung beschienen und die daraufhin emittierte Fluoreszenz von den Liganden wird mit einer sehr empfindlichen Kamera (electron-multiplying charge-coupled device) detektiert. Diese Flächendetektion verfügt nicht nur über ausreichende Empfindlichkeit um einzelne Moleküle zu detektieren, sondern ermöglicht auch die parallele Messung mehrerer Autokorrelationskurven im Sichtfeld. Zur Validierung dieses neuartigen Ansatzes wird die reversible Hybridisierung von Desoxyribonukleinsäuren (DNS) mit einem im Rahmen dieser Arbeit konstruierten totalreflexionsbasiertem Fluoreszenzmikroskop (TIRF Mikroskop) quantifiziert. Die Anzahl der hybridisierenden Basenpaare wird in dieser Studie systematisch variiert und drückt sich in klaren Änderungen der gemessenen Bindungsraten aus. Damit wird die Sensitivität der Methode unterstrichen. Darüber hinaus bedient sich diese Arbeit der konventionellen konfokalen FCS. Das Problem von Proben, die einen anderen Brechungsindex als den von Wasser aufweisen, wird intensiv im Kontext von FCS Messungen beleuchtet. Abschließend werden Messbedingungen aufgezeigt unter denen systematische Messfehler und Artefakte, die auf den Brechungsindex zurückzuführen sind, vermieden werden können. In einem Teil dieser Arbeit wird die konfokale FCS genutzt um die Polymerisation von FtsZ Proteinen (Filamenting Temperature-Sensitive Z), sowie deren Zerlegung durch das Protein MipZ, zu untersuchen. Potentielle Fehlerquellen solcher Messungen werden beleuchtet und ein neues Modell für die Analyse von konfokalen FCS Messungen an Filamenten wird hergeleitet. Die präsentierten Ergebnisse zeigen nicht nur, dass FCS eine geeignete Methode ist umWachstum und Zerfall von Filamenten im Allgemeinen zu charakterisieren, sondern liefern auch deutliche Hinweise, dass FtsZ aus dem Bakterium Caulobacter crescentus auch in Abwesenheit von Guanosintriphosphat (GTP) kurze Oligomere bildet. Letzteres ist insbesondere interessant, da typischerweise angenommen wird, dass FtsZ als monomeres Protein vorliegt und erst in Anwesenheit von GTP zu Filamenten polymerisiert. Abschließend quantifiziert diese Arbeit die Diffusion von Biomolekülen in Lipidmonoschichten an der Grenzfläche zwischen Luft und Wasser. Unter Verwendung der konfokalen FCS werden Messungen in Miniaturkammern durchgeführt und validiert. Mithilfe dieser Methode werden Messungen an Biomolekülen ermöglicht, die nur in sehr geringen Mengen aufgereinigt werden können. Die hier präsentierten Diffusionsmessungen stellen einen wichtigen Schritt hin zur FCS basierten Charakterisierung der Bindungskinetiken von Biomolekülen zu Lipidmonoschichten dar.