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Calbindin-D28k and its role in apoptosis. inhibition of Caspase-3 activity and interaction with Pro-Caspase-3 investigated by in-situ FRET microscopy
Calbindin-D28k and its role in apoptosis. inhibition of Caspase-3 activity and interaction with Pro-Caspase-3 investigated by in-situ FRET microscopy
In recent years, there was growing evidence that Calbindin-D28k, a common calcium binding protein, highly conserved among mammals, might be cytoprotective by inhibiting active Caspase-3, an important effector of apoptosis and, thereby, a crucial factor in cell physiology, oncogenesis and neurodegenerative diseases. Few in-vitro studies suggested that there might also be an interaction with the pro-domain of its zymogen, Pro-Caspase-3. To date, evidence on the various intermolecular interactions of Calbindin-D28k is essentially based on in-vitro studies. However, occasionally in-vitro studies yield results that might not correspond with conditions in living cells. To our knowledge, it is the first time that the proposed intermolecular Calbindin-D28k-Pro-Caspase-3 interaction and, moreover, the inhibition of Caspase-3 activity in a more complex, natural milieu of a cell is investigated using in-situ FRET microscopy (Acceptor-Photobleaching and Sensitized Emission). There is conclusive evidence for a calcium-independent interaction between Calbindin-D28k and an Inositol monophosphatase (IMPase) peptide sequence. Contrary to previous in-vitro studies based on peptide sequences, these results do not indicate an interaction with Pro-Caspase-3 regardless of intracellular calcium levels. This finding suggests that the inhibition of Caspase-3 activity is attributable to the intermolecular interaction with active Caspase-3. Moreover, the current findings indicate inhibition of Caspase-3 activity in a concentration-dependent manner. Further understanding of these cytoprotective pathways and mechanisms might prove beneficial to develop new cytoprotective or radio-/chemosensitizing agents and therapeutic strategies to modulate programmed cell death in neurodegenerative diseases, such as Morbus Alzheimer, Chorea Huntington or Amyotrophic lateral sclerosis, and various tumor diseases., Calbindin-D28k ist ein hoch konserviertes Kalzium-bindendes Protein, dem ein protektiver Effekt zugesprochen wird. In-vitro Studien haben gezeigt, dass Calbindin-D28k in der Lage ist, die aktive Caspase-3 zu hemmen, ein wichtiger Effektor des programmierten Zelltodes, die eine Schlüsselrolle in Zellphysiologie, Tumorentstehung und neurodegenerativen Erkrankungen einnimmt. Wenige in-vitro Studien haben ebenso zeigen können, dass eine Interaktion mit dem Zymogen, der Pro-Caspase-3, möglich ist. Bis heute stützt sich nahezu die gesamte Beweislage zu den verschiedenen intermolekularen Interaktionen von Calbindin-D28k im Wesentlichen auf in-vitro Studien. Jedoch können in-vitro Studien vereinzelt Ergebnisse hervorbringen, die sich nicht auf das komplexe Milieu von lebenden Zellen übertragen lassen. Daher untersucht die vorliegende Forschungsarbeit, die Calbindin-D28k-Pro-Caspase-3 Interaktion und die Inhibition der Caspase-3 Aktivität im komplexeren Milieu einer Zelle mittels in-situ FRET-Mikroskopie (Acceptor-Photobleaching und Sensitized Emission). Die Daten weisen auf eine Kalzium-unabhängige Interaktion zwischen Calbindin-D28k und einem Peptid der Inositol monophosphatase (IMPase) hin. Allerdings können die Ergebnisse, unabhängig von der intrazellulären Kalzium-Konzentration, keine Interaktion mit der Pro-Caspase-3 bestätigen. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu in-vitro Studien, die eine Interaktion mit den jeweiligen Peptidsequenzen zeigen konnten. Dies legt nahe, dass die Inhibition der Caspase-3 Aktivität auf die intermolekulare Interaktion mit der aktiven Caspase-3 zurückzuführen ist. Die Ergebnisse sprechen außerdem für eine konzentrationsabhängige Hemmung der Caspase-3 Aktivität. Ein tieferes Verständnis der protektiven Signalwege und Funktionsweisen kann bei der Entwicklung von neuen protektiven oder radio-/chemosensibilisierenden Pharmaka und therapeutischen Behandlungsstrategien richtungsweisend sein, die den programmierten Zelltod in neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Chorea Huntington oder Amyotrophe Lateralsklerose, aber auch diversen Tumorerkrankungen modulieren könnten.
calbindin, calcium binding protein, caspase, apoptosis, modulation, interaction, inhibition, cytoprotection, FRET, förster resonance energy transfer, photobleaching, sensitized emission, photoconversion, biosensor, caspase activity, neuron, hippocampus, inositol monophosphatase
Lohmeier, Johannes
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Lohmeier, Johannes (2018): Calbindin-D28k and its role in apoptosis: inhibition of Caspase-3 activity and interaction with Pro-Caspase-3 investigated by in-situ FRET microscopy. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

In recent years, there was growing evidence that Calbindin-D28k, a common calcium binding protein, highly conserved among mammals, might be cytoprotective by inhibiting active Caspase-3, an important effector of apoptosis and, thereby, a crucial factor in cell physiology, oncogenesis and neurodegenerative diseases. Few in-vitro studies suggested that there might also be an interaction with the pro-domain of its zymogen, Pro-Caspase-3. To date, evidence on the various intermolecular interactions of Calbindin-D28k is essentially based on in-vitro studies. However, occasionally in-vitro studies yield results that might not correspond with conditions in living cells. To our knowledge, it is the first time that the proposed intermolecular Calbindin-D28k-Pro-Caspase-3 interaction and, moreover, the inhibition of Caspase-3 activity in a more complex, natural milieu of a cell is investigated using in-situ FRET microscopy (Acceptor-Photobleaching and Sensitized Emission). There is conclusive evidence for a calcium-independent interaction between Calbindin-D28k and an Inositol monophosphatase (IMPase) peptide sequence. Contrary to previous in-vitro studies based on peptide sequences, these results do not indicate an interaction with Pro-Caspase-3 regardless of intracellular calcium levels. This finding suggests that the inhibition of Caspase-3 activity is attributable to the intermolecular interaction with active Caspase-3. Moreover, the current findings indicate inhibition of Caspase-3 activity in a concentration-dependent manner. Further understanding of these cytoprotective pathways and mechanisms might prove beneficial to develop new cytoprotective or radio-/chemosensitizing agents and therapeutic strategies to modulate programmed cell death in neurodegenerative diseases, such as Morbus Alzheimer, Chorea Huntington or Amyotrophic lateral sclerosis, and various tumor diseases.

Abstract

Calbindin-D28k ist ein hoch konserviertes Kalzium-bindendes Protein, dem ein protektiver Effekt zugesprochen wird. In-vitro Studien haben gezeigt, dass Calbindin-D28k in der Lage ist, die aktive Caspase-3 zu hemmen, ein wichtiger Effektor des programmierten Zelltodes, die eine Schlüsselrolle in Zellphysiologie, Tumorentstehung und neurodegenerativen Erkrankungen einnimmt. Wenige in-vitro Studien haben ebenso zeigen können, dass eine Interaktion mit dem Zymogen, der Pro-Caspase-3, möglich ist. Bis heute stützt sich nahezu die gesamte Beweislage zu den verschiedenen intermolekularen Interaktionen von Calbindin-D28k im Wesentlichen auf in-vitro Studien. Jedoch können in-vitro Studien vereinzelt Ergebnisse hervorbringen, die sich nicht auf das komplexe Milieu von lebenden Zellen übertragen lassen. Daher untersucht die vorliegende Forschungsarbeit, die Calbindin-D28k-Pro-Caspase-3 Interaktion und die Inhibition der Caspase-3 Aktivität im komplexeren Milieu einer Zelle mittels in-situ FRET-Mikroskopie (Acceptor-Photobleaching und Sensitized Emission). Die Daten weisen auf eine Kalzium-unabhängige Interaktion zwischen Calbindin-D28k und einem Peptid der Inositol monophosphatase (IMPase) hin. Allerdings können die Ergebnisse, unabhängig von der intrazellulären Kalzium-Konzentration, keine Interaktion mit der Pro-Caspase-3 bestätigen. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu in-vitro Studien, die eine Interaktion mit den jeweiligen Peptidsequenzen zeigen konnten. Dies legt nahe, dass die Inhibition der Caspase-3 Aktivität auf die intermolekulare Interaktion mit der aktiven Caspase-3 zurückzuführen ist. Die Ergebnisse sprechen außerdem für eine konzentrationsabhängige Hemmung der Caspase-3 Aktivität. Ein tieferes Verständnis der protektiven Signalwege und Funktionsweisen kann bei der Entwicklung von neuen protektiven oder radio-/chemosensibilisierenden Pharmaka und therapeutischen Behandlungsstrategien richtungsweisend sein, die den programmierten Zelltod in neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Chorea Huntington oder Amyotrophe Lateralsklerose, aber auch diversen Tumorerkrankungen modulieren könnten.