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Proteolytische Spaltung von humanem EpCAM und deren Einfluss auf die Zelladhäsion
Proteolytische Spaltung von humanem EpCAM und deren Einfluss auf die Zelladhäsion
EpCAM ist ein Transmembranprotein und wird auf verschiedenen Tumorentitäten de novo oder stark überexprimiert. Es wird durch eine regulatorische intramembrane Proteolyse (RIP) prozessiert. Dabei wird es zunächst extrazellulär durch ADAM Proteasen bzw. durch die BACE1 Protease gespalten. Die erste Spaltung ist somit gleichzeitig der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Das dabei entstehende Produkt (CTF-EpCAM) wird durch die γ-Sekretase mit hoher Effizienz weiter prozessiert und führt zur Freisetzung von Aβ-Fragmenten und intrazellulären Produkten (EpICD). EpICD vermittelt Proliferation durch Aktivierung von Zielgenen (Myc, FABP5). Um die extrazellulären Spaltsequenzen zu identifizieren, wurde ein EpCAM Konstrukt mit einem FLAG und TEV Epitop, welche sich 42 Aminosäuren vor der Transmembrandomäne befinden, generiert und in Karzinomzellen (HEK293, FaDu, HCT-8) stabil exprimiert. Nach Inkubation von den Karzinomzellen, mit dem EpCAM-TF Konstrukt wurden entstehende Spaltprodukte aus dem Zellkulturüberstand immunpräzipiert und massenspektrometrisch analysiert. Bei dem Vergleich von massenspektrometrisch gemessenen und theoretisch berechneten Fragmenten, ergaben sich zwei ADAM- Schnittstellen (Aspartat243/Prolin244, Prolin244/Glycin245) und eine BACE1-Schnittstelle (Tyrosin250/Tyrosin251). Zur Identifizierung der transmembranen Schnittstellen wurde ein Myc-CTF(EpCAM)- FLAG-TEV-YFP Konstrukt in Karzinomzellen (HEK293, FaDu, HCT-8) stabil exprimiert. Die Analyse der Schnittstellen erfolgte auf ähnliche Weise, wie bei den extrazellulären Schnittstellen. Fünf Schnittstellen konnten auf diese Weise identifiziert werden, wobei der γ-Schnitt zu den Schnittstellen Valin273/Valin274, Valin274/ Valin275, Valin275/ Valin276 führte und der ε-Schnitt zu den Schnittstellen Valin284/Valin285 und Valin285/Leucin286 führte. EpCAM wurde zudem als Zelladhäsions-regulierendes Protein beschrieben. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit, war es den Einfluss der regulativen intramembranen Proteolyse EpCAMs auf die Zelladhäsion zu untersuchen. Die Inhibierung der Spaltung durch α-, β- und γ-Sekretasen hatte keinen Effekt auf die Zell-Zell-Adhäsion, sowie auf die Zell-Matrix-Adhäsion. Auch ein zellulärer Knockout hEpCAMs mittels CRISPR-Cas9 Tech- nologie in HCT-8 Zellen hatte im Vergleich mit EpCAM-positiven HCT-8 WT Zellen keinen signifikanten Einfluss auf die Zelladhäsion. Um zellunabhängig das Adhäsionspotential von EpCAM zu bestimmen wurde die direkte Protein-Protein Interaktion von rekombinaten hergestellten extrazellulären EpCAM (EpEx) mittels atomic force microscopy (AFM) bestimmt. Dafür wurde zunächst ein rekombinantes hEpEx-Fc Protein aufgereinigt. Es wurde die Protein-Protein Interaktion von EpCAM bestimmt und mit den Werten von BSA (negativ Kontrolle) und dem Zelladhäsionsmolekül Desmoglein3 (positiv Kontrolle) verglichen. Es ergab sich kein signifikanter Unterschied zur negativ Kontrolle BSA. Die Untersuchung der Zelladhäsion EpCAMs auf zellulärer Basis und mittels AFM zeigte in den hier aufgeführten Experimenten keinen signifikanten direkten Einfluss auf die Zelladhäsion. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit die proteolytische Spaltung EpCAMs auf Ebene der Aminosäuren charakterisiert werden. Zudem wurde gezeigt, dass die Funktion EpCAMs, im Rahmen der hier durchgeführten Experimente, keinen direkten Einfluss auf die Zelladhäsion hat.
EpCAM (Epitheliales Zelladhäsionsmolekül), Proteolyse, Zelladhäsion, ADAM, BACE-1 (beta-Secretase)
Tsaktanis, Thanos
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Tsaktanis, Thanos (2018): Proteolytische Spaltung von humanem EpCAM und deren Einfluss auf die Zelladhäsion. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

EpCAM ist ein Transmembranprotein und wird auf verschiedenen Tumorentitäten de novo oder stark überexprimiert. Es wird durch eine regulatorische intramembrane Proteolyse (RIP) prozessiert. Dabei wird es zunächst extrazellulär durch ADAM Proteasen bzw. durch die BACE1 Protease gespalten. Die erste Spaltung ist somit gleichzeitig der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Das dabei entstehende Produkt (CTF-EpCAM) wird durch die γ-Sekretase mit hoher Effizienz weiter prozessiert und führt zur Freisetzung von Aβ-Fragmenten und intrazellulären Produkten (EpICD). EpICD vermittelt Proliferation durch Aktivierung von Zielgenen (Myc, FABP5). Um die extrazellulären Spaltsequenzen zu identifizieren, wurde ein EpCAM Konstrukt mit einem FLAG und TEV Epitop, welche sich 42 Aminosäuren vor der Transmembrandomäne befinden, generiert und in Karzinomzellen (HEK293, FaDu, HCT-8) stabil exprimiert. Nach Inkubation von den Karzinomzellen, mit dem EpCAM-TF Konstrukt wurden entstehende Spaltprodukte aus dem Zellkulturüberstand immunpräzipiert und massenspektrometrisch analysiert. Bei dem Vergleich von massenspektrometrisch gemessenen und theoretisch berechneten Fragmenten, ergaben sich zwei ADAM- Schnittstellen (Aspartat243/Prolin244, Prolin244/Glycin245) und eine BACE1-Schnittstelle (Tyrosin250/Tyrosin251). Zur Identifizierung der transmembranen Schnittstellen wurde ein Myc-CTF(EpCAM)- FLAG-TEV-YFP Konstrukt in Karzinomzellen (HEK293, FaDu, HCT-8) stabil exprimiert. Die Analyse der Schnittstellen erfolgte auf ähnliche Weise, wie bei den extrazellulären Schnittstellen. Fünf Schnittstellen konnten auf diese Weise identifiziert werden, wobei der γ-Schnitt zu den Schnittstellen Valin273/Valin274, Valin274/ Valin275, Valin275/ Valin276 führte und der ε-Schnitt zu den Schnittstellen Valin284/Valin285 und Valin285/Leucin286 führte. EpCAM wurde zudem als Zelladhäsions-regulierendes Protein beschrieben. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit, war es den Einfluss der regulativen intramembranen Proteolyse EpCAMs auf die Zelladhäsion zu untersuchen. Die Inhibierung der Spaltung durch α-, β- und γ-Sekretasen hatte keinen Effekt auf die Zell-Zell-Adhäsion, sowie auf die Zell-Matrix-Adhäsion. Auch ein zellulärer Knockout hEpCAMs mittels CRISPR-Cas9 Tech- nologie in HCT-8 Zellen hatte im Vergleich mit EpCAM-positiven HCT-8 WT Zellen keinen signifikanten Einfluss auf die Zelladhäsion. Um zellunabhängig das Adhäsionspotential von EpCAM zu bestimmen wurde die direkte Protein-Protein Interaktion von rekombinaten hergestellten extrazellulären EpCAM (EpEx) mittels atomic force microscopy (AFM) bestimmt. Dafür wurde zunächst ein rekombinantes hEpEx-Fc Protein aufgereinigt. Es wurde die Protein-Protein Interaktion von EpCAM bestimmt und mit den Werten von BSA (negativ Kontrolle) und dem Zelladhäsionsmolekül Desmoglein3 (positiv Kontrolle) verglichen. Es ergab sich kein signifikanter Unterschied zur negativ Kontrolle BSA. Die Untersuchung der Zelladhäsion EpCAMs auf zellulärer Basis und mittels AFM zeigte in den hier aufgeführten Experimenten keinen signifikanten direkten Einfluss auf die Zelladhäsion. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit die proteolytische Spaltung EpCAMs auf Ebene der Aminosäuren charakterisiert werden. Zudem wurde gezeigt, dass die Funktion EpCAMs, im Rahmen der hier durchgeführten Experimente, keinen direkten Einfluss auf die Zelladhäsion hat.