Inhibition of human prostate smooth muscle contraction by the LIM kinase inhibitors, SR7826 and LIMKi3

Yu, Qingfeng (2018): Inhibition of human prostate smooth muscle contraction by the LIM kinase inhibitors, SR7826 and LIMKi3. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

LUTS refer to a group of urological symptoms that are caused by multifactorial aetiology. The prevalence of LUTS increases with age, and will thereby lead to heavy economic burden for the society. In men with benign prostate hyperplasia, increased smooth muscle tone in the prostate could result in bladder outlet obstruction and subsequent symptoms of lower urinary tract. Pharmacological treatment aiming to inhibit prostate smooth muscle contraction is considered as the option of first choice. However, the efficacy of current available treatment options is limited, thereby, improved understanding in the mechanisms of prostate smooth muscle contraction and development of novel targets for medical therapy are warranted. Previous studies have reported that LIMK (LIMK1 and LIMK2) phosphorylate cofilin and act as regulators of actin-myosin cytoskeletal dynamics, which result in actin polymerization, filament assemble, and stress fiber formation in smooth muscle cells. This may suggest that LIMKs promote smooth muscle contraction, however, not any associated study has been conducted. In this project, we aimed to explore the effects of LIMK inhibitors on prostate smooth muscle contraction. Human prostate tissues were obtained from patients who underwent radical prostatectomy. RT-PCR, western blot and immunofluorescence were performed to detect LIMK in smooth muscle cells of prostate tissues. Phosphorylation of cofilin, a LIMK substrate, was detected by a phospho-specific antibody. Effects of LIMK inhibitors on smooth muscle contraction of prostate strips were performed with organ bath. Expression of LIMK in smooth muscle cells of prostate tissues was suggested by RT-PCR, Western blot and immunofluorescence, while higher expression level of LIMK was detected in prostate tissues than that in WPMY-1 cells. Two LIMK inhibitors, SR7826 (1 µM) and LIMKi3 (1 µM), showed significant effects on inhibiting contractions of prostate strips, which were induced by the α1-adrenoceptor agonists, noradrenaline, phenylephrine and methoxamine, by the thromboxane A2 analogue, U46619, and by EFS. Reduced phosphorylation of cofilin in prostate tissues treated with inhibitors was observed, which confirmed LIMK inhibition by SR7826 and LIMKi3. In WPMY-1 cells, a line of cultured cells from the prostate stroma, SR7826 and LIMKi3 were observed to cause breakdown of actin filaments and reduced viability in a concentration-dependent manner. Together, this is the first study to explore the effects of small molecule LIMK inhibitors on regulating prostate smooth muscle contraction. The present study suggested that LIMKs promote prostate smooth muscle contraction by phosphorylating cofilin and subsequent causing actin organization, which could be inhibited by small molecule LIMK inhibitors, SR7826 and LIMKi3. Therefore, this project provides a possible novel therapy target for LUTS, although in vivo studies using animal models would be still warranted before clinical application.

Abstract

Der Sammelbegriff LUTS beschreibt eine Gruppe urologischer Beschwerden beim Wasserlassen mit vielfältiger Ätiologie. Ihre Prävalenz steigt mit dem Alter der Patientinnen und Patienten, und stellt auf Grund der demographischen Bevölkerungsentwicklung einen erheblichen sozioökonomischen Faktor von stark zunehmender Bedeutung dar. Bei Männern mit einer gutartigen Prostatavergrößerung (Benigne Prostatahyperplasie, BPH) führt ein erhöhter glattmuskulärer Tonus in der hyperplastischen Prostata häufig zu einer Verengung der Harnröhre und verursacht so eine Blasenauslassstörung (bladder outlet obstruction, BOO), und hierdurch zu Beeinträchtigungen der Blasenentleerung und Beschwerden beim Wasserlassen. Folglich zielen die Optionen der ersten Wahl zur medikamentösen Behandlung auf eine Hemmung der glattmuskulären Kontraktion in der Prostata ab. Die Effektivität der zur Verfügung stehenden Medikamente ist jedoch stark begrenzt, woraus sich ein dringender Bedarf an einem verbessertes Verständnis der Kontraktionsmechanismen und an der Identifizierung möglicher neuer Angriffspunkte ergibt. Verschiedene Studien zeigten, dass die LIM Kinasen (LIMK) über die Phosphorylierung von Cofilin in glatten Muskelzellen die Polymerisation von Aktin und dessen Filamentbildung fördern, was eine unabdingbare Voraussetzung der glattmuskulären Kontraktion darstellt. Dies legt zwar eine Rolle der LIMK für die glattmuskuläre Kontraktion nahe, was erstaunlicherweise bislang jedoch nie gezeigt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Effekte von LIMK-Inhibitoren auf die glattmuskuläre Kontraktion humaner Prostatagewebe untersucht. Die hier verwendeten Prostatagewebe wurden im Rahmen von Tumor-bedingten, radikalen Prostatektomien gewonnen. Zur Detektion einer möglichen LIMK-Expression wurden RT-PCRs, Western-Blot Analysen und Fluoreszenz-Färbungen durchgeführt. Phosphoryliertes Cofilin wurde mit einem phospho-spezifischen Antikörper detektiert. Die Effekte von LIMK-Inhibitoren auf die Kontraktion von Prostatageweben wurden in myographischen Messungen in einem Organbad untersucht. Ergänzend wurden Untersuchungen in WPMY-1-Zellen durchgeführt, einer Zelllinie aus dem Stroma einer humanen Prostata. Die Ergebnisse aus RT-PCR, Western-Blot Analysen und Fluoreszenz-Färbungen legten eine LIMK-Expression in humanen Prostata-Geweben nahe, wobei LIMK1 offenbar in den glatten Muskelzellen des Stromas vorkommt. Diese Gewebe zeigten höhere Expressions-Level als WPMY-1-Zellen. Zwei strukturell unterschiedliche LIMK-Inhibitoren, SR7826 (1 µM) und LIMKi3 (1 µM) führten zu signifikanten Hemmung der Kontraktion von Prostata-Geweben, welche durch die α1-Adrenozeptor-Agonisten Noradrenalin, Phenylephrin und Methoxamin, sowie durch das Thromboxan-Analogon U46619, bzw. durch Ausschüttung endogener Neurotransmitter nach elektrischer Feldstimulation (EFS) ausgelöst wurden. Die Hemmung der LIMK durch SR7826 und LIMKi3 in Prostatageweben wurde durch eine Verminderung der Cofilin-Phosphorylierung bestätigt. In WPMY-1-Zellen verursachten SR7826 und LIMKi3 Konzentrations-abhängig einen Zusammenbruch der Aktin-Filamente und der Aktin-Polymerisation, sowie eine Verminderung der Viabilität. Dies stellt die vermutlich erste Studie dar, welche eine Hemmung der glattmuskulären (Prostata-)Kontraktion durch LIMK-Inhibitoren zeigt. Die Ergebnisse legen nahe, dass LIMK die glattmuskuläre Kontraktion in der Prostata antreiben, was durch eine Phosphorylierung von Cofilin und eine daraus resultierende Bildung oder Aufrechterhaltung von Aktin-Filamenten erfolgt. Sowohl die glattmuskuläre Kontraktion als auch die Organisation der Aktin-Filamente ließen sich in der Prostata durch SR7826 und LIMKi3 hemmen. Daher könnten LIM Kinasen einen neuen Angriffspunkt für mögliche neue LUTS-Therapien darstellen; jedoch sind in vivo Studien in Tiermodellen erforderlich, bevor diese Hemmstoffe in klinischen Studien verabreicht werden können.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: LIM kinase inhibitor, SR7826, LIMKi3, Smooth muscle contraction, LUTS, prostate
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 19. April 2018
• 1. Bericht­erstatter:in: Stief, Christian Georg