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Mechanismen der Tumortherapie mit Immunkontrollpunkt-Inhibitoren. Rolle von T-Zell-Aktivierung und zellulärer Seneszenz
Mechanismen der Tumortherapie mit Immunkontrollpunkt-Inhibitoren. Rolle von T-Zell-Aktivierung und zellulärer Seneszenz
Die Antikörper-gesteuerte Modifikation von gegenregulatorischen Rezeptoren wie CTLA-4 und PD-1, sogenannten Immun-Kontrollpunkten, wird als neue Säule der Tumortherapie bereits seit einigen Jahren erfolgreich in der Klinik eingesetzt. Gegen CTLA-4 und PD-1 gerichtete Antikörper sollen durch Inhibierung der immunologischen T-Zell-Bremse die Funktion tumorantigenspezifischer T-Effektorzellen und damit die Ausbildung einer effektiven Antitumor-Immunität stimulieren. Ein herausragendes Merkmal der Kontrollpunkt-Inhibitoren ist die Induktion langanhaltender Immunantworten, die das Wachstum bereits bestehender Tumoren und Metastasen kontrollieren und so zu Langzeit-Überlebensraten führen, die vor wenigen Jahren noch undenkbar waren. Die kombinatorische Hemmung von CTLA-4 und PD-1 ist den jeweiligen Monotherapien überlegen und bereits für die klinische Anwendung zugelassen. Trotz eines stetig wachsenden Indikations-Spektrums gegen solide und hämatologische Tumorarten wurde die genaue Wirkweise dieser neuen Immuntherapeutika bisher nicht geklärt. Um Mechanismen zu untersuchen, die für das verbesserte Überleben nach der therapeutischen Blockade von PD-1 und CTLA-4 verantwortlich sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit das endogene λ-MYC-Lymphommodell der Maus verwendet. Dieses Spontan-Tumormodell, welches dem klinischen Bild des humanen Burkitt-Lymphoms entspricht, ermöglichte neben der Untersuchung von Immunantworten während der Tumorentwicklung auch die therapeutische Intervention mit αPD-1/αCTLA-4-Antikörpern. Neben NK-Zellen und DZ waren auch T-Zellen im λ-MYC-Tumor trotz eines aktivierten Phänotyps in ihrer Funktion eingeschränkt. Bedingt durch die chronische Tumorantigen-Stimulation zeigte ein Teil der tumorinfiltrierenden T-Effektorzellen eine zunehmende funktionelle Erschöpfung. Die Suppression der T-Zellen im Tumor wurde durch den gesteigerten Anteil immunsupprimierender CD4+Foxp3+ Treg und die Hochregulierung inhibitorischer Rezeptoren verstärkt, so dass tumorreaktive T-Zellen die Lymphomentwicklung in λ-MYC-Tieren nicht verhindern konnten. Die auf intratumoralen T-Lymphozyten hochregulierten Moleküle PD-1 und CTLA-4 stellten geeignete Strukturen für den zielgerichteten Einsatz von αPD-1/αCTLA-4-Antikörpern dar, welche inhibitorische Signale aufheben und eine effektive Antitumor-Immunantwort induzieren sollten. Tatsächlich konnte die In-vivo-Doppelblockade von PD-1 und CTLA-4 die Tumorprogression in λ-MYC-Mäusen signifikant verzögern und die Tumorentwicklung bei einigen Tieren gänzlich unterdrücken. Dies wurde auf die wiederhergestellte Effektorfunktion der intratumoralen CD4+ und CD8+ T-Zellen nach αPD-1/αCTLA-4-Therapie zurückgeführt, welche sich in einer verstärkten Aktivierung, IFN-γ- und TNF-Sekretion sowie In-vitro-Proliferation äußerte. Einige der λ-MYC-Tiere wurden durch die PD-1-/CTLA-4-Blockade geheilt; dafür bot die Tumordestruktion durch aktivierte T-Zellen eine Erklärung. Doch bei den meisten Mäusen wurde kein Langzeitüberleben beobachtet, sondern eine starke Verzögerung des Tumorwachstums. Hier wurde durch den unveränderten Anteil der CD19+ Lymphomzellen nach αPD-1/αCTLA-4-Behandlung gezeigt, dass diese nicht durch reaktivierte T-Effektorzellen zerstört worden waren. Da sowohl die Seneszenz, die durch einen irreversiblen Proliferations-Stopp gekennzeichnet ist, als auch die Apoptose primäre zelluläre Verteidigungsmechanismen zur Unterdrückung der Tumorgenese sind, wurden sie als potenzielle Ursachen für das verzögerte Tumorwachstum nach αPD-1/αCTLA-4-Behandlung untersucht. Während nach der In-vivo-PD-1/CTLA-4-Blockade eine geringe Apoptoseinduktion in Tumorzellen beobachtet wurde, hatte der Anteil seneszenter CD19+ Lymphomzellen signifikant zugenommen. Mithilfe transgener Mäuse konnte der direkte Zusammenhang zwischen Seneszenzinduktion und verbesserter Tumorkontrolle nach αPD-1/ αCTLA-4-Therapie in vivo belegt werden. Durch die genetische Ausschaltung des Seneszenz-Gens p21 in λ-MYC-Mäusen konnte die Antikörper-Therapie das Überleben der Tiere nicht mehr signifikant verlängern. Im λ-MYC-Lymphommodell kamen demnach die zelluläre Seneszenz und in geringerem Maße die Apoptose als Mechanismen für die Tumor-Wachstumsarretierung nach αPD-1/ αCTLA-4-Therapie in Frage. In Lymphomzellen, welche aus λ-MYC-Tumoren generiert worden waren, konnte in vitro durch Zugabe der immunstimulierenden Zytokine rIFN-γ und rTNF Seneszenz induziert werden. Da T-Zellen nach In-vivo-PD-1/CTLA-4-Blockade vermehrt IFN-γ und TNF sezernierten, wurde der direkte Einfluss dieser Zytokine auf die verbesserte Tumorkontrolle nach αPD-1/αCTLA-4-Gabe analysiert. Die In-vivo-Neutralisierung sowohl von IFN-γ als auch von TNF führte zu einer Aufhebung des Therapieerfolges nach Kontrollpunkt-Hemmung sowie zu einer Reduktion der Therapie-induzierten Seneszenz in Tumorzellen. Damit konnte die Notwendigkeit von IFN-γ und TNF für den therapeutischen Erfolg der Antikörper-Therapie gezeigt werden. Die gesteigerte Produktion von IFN-γ und TNF nach In-vivo-PD-1/CTLA-4-Blockade wurde auf reaktivierte NK- und T-Zellen zurückgeführt. Um deren Rolle als IFN-γ- und TNF-Produzenten für den Therapieerfolg zu untersuchen, wurden diese Zellpopulationen während der αPD-1/αCTLA-4-Behandlung in vivo depletiert. Durch den Einsatz NK-Zell-depletierender Antikörper wurde das Überleben der λ-MYC-Mäuse reduziert und somit die zytokinabhängige Tumorsuppression durch Kontrollpunkt-Inhibitoren belegt. Der Verlust der CD8+ und CD4+ T-Zellen in λ-MYC-Mäusen ließ überraschenderweise keinen signifikanten Überlebensunterschied zu Tieren, die nur αPD-1/ αCTLA-4-Antikörper erhalten hatten, erkennen. Dennoch stach hervor, dass es nach der T-Zell-Depletion keine Langzeitüberleber gab. Daraus wurde geschlossen, dass NK-Zellen nach Kontrollpunkt-Blockade für die Bereitstellung von IFN-γ, welches essenziell für die Tumorkontrolle und Seneszenzinduktion in Lymphomzellen ist, genügen. Für die komplette Zerstörung der Tumorzellen und damit ein Langzeitüberleben waren hingegen T-Zellen notwendig. Zu den Strategien der Immunevasion im Tumor gehört auch der erhöhte Anteil von CD4+Foxp3+ Treg, deren suppressive Kapazität in vitro nachgewiesen wurde. Im Vergleich zu wt-Mäusen wurde in λ-MYC-Tieren eine erhöhte Expression der inhibitorischen Rezeptoren CTLA-4 und PD-1 auf intratumoralen T-Zellen, insbesondere auf Foxp3+ Treg, sowie die verstärkte Sekretion des immuninhibierenden Zytokins IL-10 beobachtet. Da CTLA-4+ Treg zudem mehr IL-10 produzierten als CTLA-4-negative Treg, könnten intratumorale Treg mit einer besonders hohen CTLA-4-Expression die Αntitumor-Antwort der T-Effektorzellen durch ihre gesteigerte IL-10-Sekretion noch stärker beeinträchtigen. Die meisten intratumoralen Treg wurden als Helios-exprimierende natürliche nTreg identifiziert, die konstitutiv Foxp3+ exprimieren und Selbst-Antigene erkennen. In geringerem Maße wurden im λ-MYC-Tumor Helios- iTreg gefunden, welche peripher aus CD4+Foxp3- Teff induziert werden und Fremd-Antigene erkennen. Trotz der allgemeinen Annahme, dass hauptsächlich iTreg IL-10 ausschütten, wurde die IL-10-Produktion im λ-MYC-Modell gleichermaßen auf nTreg wie auf iTreg zurückgeführt. Die auf nTreg signifikant erhöhte Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 und des Oberflächenproteins CD137, welches nach TZR-spezifischer Aktivierung hochreguliert wird, lässt auf eine dominante Rolle der Helios+ nTreg für die Inhibierung der Immunantwort im λ-MYC-Tumor schließen. Demnach schienen Treg nach Erkennung tumorassoziierter Antigene verstärkt zu proliferieren, was in einer In-vitro-Kokultur bestätigt werden konnte. Diese im λ-MYC-Lymphommodell gewonnenen Resultate zeigen einen neuen Wirkmechanismus der Immun-Kontrollpunkt-Inhibitoren. Diese Kenntnisse sind relevant, um den klinischen Einsatz dieser modernen zielgerichteten Antikörper zu optimieren und die Entwicklung neuer Tumor-Immuntherapien voranzutreiben.
Not available
Ahmetlic, Fatima
2018
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Ahmetlic, Fatima (2018): Mechanismen der Tumortherapie mit Immunkontrollpunkt-Inhibitoren: Rolle von T-Zell-Aktivierung und zellulärer Seneszenz. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Die Antikörper-gesteuerte Modifikation von gegenregulatorischen Rezeptoren wie CTLA-4 und PD-1, sogenannten Immun-Kontrollpunkten, wird als neue Säule der Tumortherapie bereits seit einigen Jahren erfolgreich in der Klinik eingesetzt. Gegen CTLA-4 und PD-1 gerichtete Antikörper sollen durch Inhibierung der immunologischen T-Zell-Bremse die Funktion tumorantigenspezifischer T-Effektorzellen und damit die Ausbildung einer effektiven Antitumor-Immunität stimulieren. Ein herausragendes Merkmal der Kontrollpunkt-Inhibitoren ist die Induktion langanhaltender Immunantworten, die das Wachstum bereits bestehender Tumoren und Metastasen kontrollieren und so zu Langzeit-Überlebensraten führen, die vor wenigen Jahren noch undenkbar waren. Die kombinatorische Hemmung von CTLA-4 und PD-1 ist den jeweiligen Monotherapien überlegen und bereits für die klinische Anwendung zugelassen. Trotz eines stetig wachsenden Indikations-Spektrums gegen solide und hämatologische Tumorarten wurde die genaue Wirkweise dieser neuen Immuntherapeutika bisher nicht geklärt. Um Mechanismen zu untersuchen, die für das verbesserte Überleben nach der therapeutischen Blockade von PD-1 und CTLA-4 verantwortlich sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit das endogene λ-MYC-Lymphommodell der Maus verwendet. Dieses Spontan-Tumormodell, welches dem klinischen Bild des humanen Burkitt-Lymphoms entspricht, ermöglichte neben der Untersuchung von Immunantworten während der Tumorentwicklung auch die therapeutische Intervention mit αPD-1/αCTLA-4-Antikörpern. Neben NK-Zellen und DZ waren auch T-Zellen im λ-MYC-Tumor trotz eines aktivierten Phänotyps in ihrer Funktion eingeschränkt. Bedingt durch die chronische Tumorantigen-Stimulation zeigte ein Teil der tumorinfiltrierenden T-Effektorzellen eine zunehmende funktionelle Erschöpfung. Die Suppression der T-Zellen im Tumor wurde durch den gesteigerten Anteil immunsupprimierender CD4+Foxp3+ Treg und die Hochregulierung inhibitorischer Rezeptoren verstärkt, so dass tumorreaktive T-Zellen die Lymphomentwicklung in λ-MYC-Tieren nicht verhindern konnten. Die auf intratumoralen T-Lymphozyten hochregulierten Moleküle PD-1 und CTLA-4 stellten geeignete Strukturen für den zielgerichteten Einsatz von αPD-1/αCTLA-4-Antikörpern dar, welche inhibitorische Signale aufheben und eine effektive Antitumor-Immunantwort induzieren sollten. Tatsächlich konnte die In-vivo-Doppelblockade von PD-1 und CTLA-4 die Tumorprogression in λ-MYC-Mäusen signifikant verzögern und die Tumorentwicklung bei einigen Tieren gänzlich unterdrücken. Dies wurde auf die wiederhergestellte Effektorfunktion der intratumoralen CD4+ und CD8+ T-Zellen nach αPD-1/αCTLA-4-Therapie zurückgeführt, welche sich in einer verstärkten Aktivierung, IFN-γ- und TNF-Sekretion sowie In-vitro-Proliferation äußerte. Einige der λ-MYC-Tiere wurden durch die PD-1-/CTLA-4-Blockade geheilt; dafür bot die Tumordestruktion durch aktivierte T-Zellen eine Erklärung. Doch bei den meisten Mäusen wurde kein Langzeitüberleben beobachtet, sondern eine starke Verzögerung des Tumorwachstums. Hier wurde durch den unveränderten Anteil der CD19+ Lymphomzellen nach αPD-1/αCTLA-4-Behandlung gezeigt, dass diese nicht durch reaktivierte T-Effektorzellen zerstört worden waren. Da sowohl die Seneszenz, die durch einen irreversiblen Proliferations-Stopp gekennzeichnet ist, als auch die Apoptose primäre zelluläre Verteidigungsmechanismen zur Unterdrückung der Tumorgenese sind, wurden sie als potenzielle Ursachen für das verzögerte Tumorwachstum nach αPD-1/αCTLA-4-Behandlung untersucht. Während nach der In-vivo-PD-1/CTLA-4-Blockade eine geringe Apoptoseinduktion in Tumorzellen beobachtet wurde, hatte der Anteil seneszenter CD19+ Lymphomzellen signifikant zugenommen. Mithilfe transgener Mäuse konnte der direkte Zusammenhang zwischen Seneszenzinduktion und verbesserter Tumorkontrolle nach αPD-1/ αCTLA-4-Therapie in vivo belegt werden. Durch die genetische Ausschaltung des Seneszenz-Gens p21 in λ-MYC-Mäusen konnte die Antikörper-Therapie das Überleben der Tiere nicht mehr signifikant verlängern. Im λ-MYC-Lymphommodell kamen demnach die zelluläre Seneszenz und in geringerem Maße die Apoptose als Mechanismen für die Tumor-Wachstumsarretierung nach αPD-1/ αCTLA-4-Therapie in Frage. In Lymphomzellen, welche aus λ-MYC-Tumoren generiert worden waren, konnte in vitro durch Zugabe der immunstimulierenden Zytokine rIFN-γ und rTNF Seneszenz induziert werden. Da T-Zellen nach In-vivo-PD-1/CTLA-4-Blockade vermehrt IFN-γ und TNF sezernierten, wurde der direkte Einfluss dieser Zytokine auf die verbesserte Tumorkontrolle nach αPD-1/αCTLA-4-Gabe analysiert. Die In-vivo-Neutralisierung sowohl von IFN-γ als auch von TNF führte zu einer Aufhebung des Therapieerfolges nach Kontrollpunkt-Hemmung sowie zu einer Reduktion der Therapie-induzierten Seneszenz in Tumorzellen. Damit konnte die Notwendigkeit von IFN-γ und TNF für den therapeutischen Erfolg der Antikörper-Therapie gezeigt werden. Die gesteigerte Produktion von IFN-γ und TNF nach In-vivo-PD-1/CTLA-4-Blockade wurde auf reaktivierte NK- und T-Zellen zurückgeführt. Um deren Rolle als IFN-γ- und TNF-Produzenten für den Therapieerfolg zu untersuchen, wurden diese Zellpopulationen während der αPD-1/αCTLA-4-Behandlung in vivo depletiert. Durch den Einsatz NK-Zell-depletierender Antikörper wurde das Überleben der λ-MYC-Mäuse reduziert und somit die zytokinabhängige Tumorsuppression durch Kontrollpunkt-Inhibitoren belegt. Der Verlust der CD8+ und CD4+ T-Zellen in λ-MYC-Mäusen ließ überraschenderweise keinen signifikanten Überlebensunterschied zu Tieren, die nur αPD-1/ αCTLA-4-Antikörper erhalten hatten, erkennen. Dennoch stach hervor, dass es nach der T-Zell-Depletion keine Langzeitüberleber gab. Daraus wurde geschlossen, dass NK-Zellen nach Kontrollpunkt-Blockade für die Bereitstellung von IFN-γ, welches essenziell für die Tumorkontrolle und Seneszenzinduktion in Lymphomzellen ist, genügen. Für die komplette Zerstörung der Tumorzellen und damit ein Langzeitüberleben waren hingegen T-Zellen notwendig. Zu den Strategien der Immunevasion im Tumor gehört auch der erhöhte Anteil von CD4+Foxp3+ Treg, deren suppressive Kapazität in vitro nachgewiesen wurde. Im Vergleich zu wt-Mäusen wurde in λ-MYC-Tieren eine erhöhte Expression der inhibitorischen Rezeptoren CTLA-4 und PD-1 auf intratumoralen T-Zellen, insbesondere auf Foxp3+ Treg, sowie die verstärkte Sekretion des immuninhibierenden Zytokins IL-10 beobachtet. Da CTLA-4+ Treg zudem mehr IL-10 produzierten als CTLA-4-negative Treg, könnten intratumorale Treg mit einer besonders hohen CTLA-4-Expression die Αntitumor-Antwort der T-Effektorzellen durch ihre gesteigerte IL-10-Sekretion noch stärker beeinträchtigen. Die meisten intratumoralen Treg wurden als Helios-exprimierende natürliche nTreg identifiziert, die konstitutiv Foxp3+ exprimieren und Selbst-Antigene erkennen. In geringerem Maße wurden im λ-MYC-Tumor Helios- iTreg gefunden, welche peripher aus CD4+Foxp3- Teff induziert werden und Fremd-Antigene erkennen. Trotz der allgemeinen Annahme, dass hauptsächlich iTreg IL-10 ausschütten, wurde die IL-10-Produktion im λ-MYC-Modell gleichermaßen auf nTreg wie auf iTreg zurückgeführt. Die auf nTreg signifikant erhöhte Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 und des Oberflächenproteins CD137, welches nach TZR-spezifischer Aktivierung hochreguliert wird, lässt auf eine dominante Rolle der Helios+ nTreg für die Inhibierung der Immunantwort im λ-MYC-Tumor schließen. Demnach schienen Treg nach Erkennung tumorassoziierter Antigene verstärkt zu proliferieren, was in einer In-vitro-Kokultur bestätigt werden konnte. Diese im λ-MYC-Lymphommodell gewonnenen Resultate zeigen einen neuen Wirkmechanismus der Immun-Kontrollpunkt-Inhibitoren. Diese Kenntnisse sind relevant, um den klinischen Einsatz dieser modernen zielgerichteten Antikörper zu optimieren und die Entwicklung neuer Tumor-Immuntherapien voranzutreiben.