Surrogate MRI markers for chemodosimetry of doxorubicin with thermosensitive liposomes in tumors

Willerding, Linus (2017): Surrogate MRI markers for chemodosimetry of doxorubicin with thermosensitive liposomes in tumors. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Purpose: The efficacy of systemically-applied anti-cancer drugs is limited by insufficient selectivity, and the maximum applicable dose is limited by side effects. Improved effec-tiveness can be achieved by targeting the cytotoxic drugs directly to the tumor. Using thermosensitive liposomes (TSL) as drug carriers, such targeting is achieved by control of temperature in the target volume. The approach can be further improved by magnetic resonance imaging guided local hyperthermia (HT) to visualize the content release using contrast agent (CA)-loaded TSL. Such visualization is considered to be an important tool for further improvement of HT/chemotherapy concepts based on TSL, and may facilitate chemodosimetry during HT. Real-time imaging of drug targeting offers better treatment control, and is an important step towards personalized medicine. Therefore, in this work quantitative assessment of HT-induced doxorubicin release (chemodosimetry) in tumors is examined by injecting a mixture of TSL loaded with CA or DOX into the tumors, and using MRI parameters. Methods: In the first part of this work a novel laser light-based HT devise was developed to investigate MRI-guided HT for preclinical research. To prove its effectiveness, the new device was compared systematically with the frequently used cold light lamp and water bath HT. Experiments were performed in 18 male Brown Norway rats with a syngeneic soft tissue sarcoma (BN 175) located on each hind leg. One tumor was heated while the second tumor remained unheated as a reference. Six animals were investigated per HT method. DPPG2-TSL were injected i.v. at a stable tumor temperature above 40 °C. Thereaf-ter, temperature was maintained for 60 min. Total DOX concentration in plasma, tumor tissue, and muscle was determined post-therapy by high pressure liquid chromatography (HPLC). In the second part, the new HT device was used to identify surrogate MRI markers to quantify HT-enhanced DOX delivery to a heated tumor. These experiments were per-formed in an additional six male Brown Norway rats with one syngeneic tissue soft tissue sarcoma (BN175) located on each hind leg. Tumor temperature was monitored using an intratumoral fiberoptic temperature probe. In group A (N=4), one tumor was superficially selectively heated by a 940 nm diode laser with a new MRI-compatible applicator, while the second tumor remained unheated. After reaching a temperature of 40°C, a bolus of mixed DPPG2-TSL and CA-TSL was administered i.v.. After 1 h, HT was stopped and the tumor was allowed to cool down to the temperature determined pre-HT. In group B (N=2), the same experiment was performed without HT. Finally, tumors were excised for DOX measurement by HPLC. MRI was performed at 3T. T1-mapping using variable flip angle was established before and after HT. Furthermore, dynamic mapping of T1 and the phase were performed during the experiment. Phase change (PC), T1- and T1-related parameters (absolute and relative changes), or areas under the curve (AUC) of T1dyn(t) were correlat-ed with the DOX enhancement in the corresponding tissue. Results: All heating methods exhibited highly effective DOX delivery by TSL with 4.5 23.1 ng/mg found in the heated tumors. In contrast, the mean DOX concentration in the unheated tumors, and in abdominal muscle, was 0.5 ± 0.1 ng/mg. Independent of the HT methods investigated during this study, more DOX was found in the smaller tumors. By comparison, the water bath induced the lowest DOX delivery in large tumors, but still dis-played a fourfold higher DOX compared to the un-heated tumors. Using the laser-based applicator, a DOX deposition 13 times higher than levels found in unheated tumors was possible for larger tumors, where levels in smaller tumors were recorded 15 times higher compared to the unheated tumors. Temperature gradients inside the tumor volume were higher with the laser and cold light lamp (– 0.3 °C/mm to – 0.5 °C /mm) than with the wa-ter bath (– 0.1 °C/mm and – 0.2 °C/mm). The MRI experiments for chemodosimetry in group A showed a tumor temperature of 41.1±1.2°C during one hour. HPLC of 18 tumor samples demonstrated highly efficient DOX delivery to heated tumors. Compared to unheated tumors, DOX delivery was increased by a factor of 9.4 ± 2.9. All investigated T1 and PC parameters were highly correlated with DOX concentrations measured by HPLC. Using the highly significant linear relationship of MRI and DOX, MRI-derived DOX parameter maps of the tumors were calculated. Conclusion: The comparative work with different heating methods has demonstrated that DPPG2-TSL drug delivery and targeting is highly effective independently from the HT method. Nevertheless, it was also shown that the effectiveness of the therapies is depend-ent on the method of heating and on tumor size. Both factors must be considered in study designs, and when comparing results with other studies in temperature-triggered drug delivery. In this work, the cold light lamp and new laser applicator furnished more efficient drug delivery than water bath heating. Furthermore, this was the first time that a mixture of TSL encapsulating either a clinically approved CA or DOX has been investigated for in vivo DOX concentration assessment. An assessment and visualization of DOX deposited in tumors was possible with the MRI. A variety of static or dynamic MRI surrogate markers based on T1 or phase appeared to cor-relate with the DOX concentration in the tumor tissue. MR thermometry was affected by CA-TSL, but phase information was confirmed to be suitable for DOX assessment. Local DOX differences in the tumors indicated the need for visualization of drug release for fur-ther improvement of targeted chemotherapy. In conclusion, promising MRI surrogate parameters were also identified for the assessment of DOX tissue concentration when using a mixture of CA-TSL and DOX-TSL.

Abstract

Motivation: Die therapeutische Wirkung von systemisch verabreichten Chemotherapeu-tika in soliden Tumoren ist limitiert durch die fehlende Selektivität der Medikamente und die maximal mögliche verabreichbare Dosis welche durch Nebenwirkungen begrenzt ist. Die Effektivität kann durch ein gezieltes Freisetzen der Medikamente im Tumor gesteigert werden. Mit Hilfe von temperatursensitiven Liposomen (TSL) ist es möglich die Freiset-zung des Medikaments durch lokaler Temperaturerhöhung (HT) zu steuern. Eine Mög-lichkeit zur weiteren Verbesserung dieser Methodik bietet die Visualisierung der Wirk-stofffreisetzung mit Hilfe der Magnetresonanztomographie (MRT) gestützten lokalen HT. Dies wird durch die Beladung der TSL mit MRT Kontrastmittel (CA) erreicht. Die Visuali-sierung wird als Voraussetzung zur Verbesserung der HT kombiniert mit der Chemothe-rapie mit TSL gesehen und ermöglicht eine Chemodosimetrie während der HT. Die Analyse der Wirkstoffaufnahme in den Tumor in Echtzeit ermöglicht eine bessere Therapiesteu-erung und ist ein Schritt hin zur personalisierten Medizin. Ziel dieser Arbeit war daher die quantitative Bestimmung des durch HT im Gewebe freigesetzten Medikaments im Tumor unter Verwendung verschiedener MRT Parameter und mit Hilfe von DOX beladenen TSL gemischt mit CA beladenen TSL. Methoden: Um eine vorklinische Untersuchung zur MRT-überwachten Hyperthermie zu ermöglichen wurde ein MR-kompatibler, auf Laserlicht basierender HT-Applikator entwi-ckelt. Die Effektivität dieses neuen Applikators wurde in einer ersten Studie systematisch durch den Vergleich mit etablierten experimentellen Erwärmungsmethoden wie einer Kaltlichtlampe und einem Wasserbad getestet. Bei 18 männlichen „Brown Norway“ Ratten mit syngenen Weichteilsarkomen (BN 175) an beiden Hinterläufen wurde jeweils nur ein Tumor erwärmt. Der zweite, nicht erwärmte Tumor diente als Referenz. Die Wirkung der drei Erwärmungsmethoden auf die erreichte DOX-Konzentration wurde an jeweils 6 Tieren untersucht. Nach Erreichen einer stabilen Tumortemperatur von über 40°C unter Verwendung einer der drei HT-Methoden wurde eine Mischung aus DPPG2-TSL mit ver-kapseltem DOX oder CA intravenös injiziert. Anschließend wurde die Tumortemperatur über weitere 60min stabil gehalten. Nach der Behandlung wurde die DOX Konzentration im Plasma, im Tumor und im Muskelgewebe mit der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gemessen. Mit dem neuen Laserlicht basierten HT-Applikator wurden in einer zweiten Studie mögli-che MR Parameter für eine MR-gestützte Chemodosimetrie an 6 männlichen „Brown Nor-way“ Raten mit jeweils einem syngenen Weichteilsarkom (BN 175) an jedem Hinterlauf untersucht. In einer Gruppe (A) mit 4 Tieren wurde jeweils ein Tumor mit dem neuen MRT kompatiblen Laserapplikator erwärmt, während der zweite nicht erwärmte Tumor als Kontrolle diente. Nachdem im erwärmten Tumor eine stabile Temperatur über 40 °C erreicht wurde, ist ein Gemisch aus DPPG2-TSL und CA-TSL i.v. injiziert worden. Nach einer Stunde wurde die Erwärmung gestoppt und der Tumor kühlte bis auf die Temperatur vor der Erwärmung ab. In der zweiten Gruppe (B, N=2) wurde das gleiche Experiment, jedoch ohne Erwärmung durchgeführt. Die Tumortemperatur wurde bei allen Untersuchungen mit einer intratumoral gelegten fiberoptischen Temperatursonde überwacht. Nach Abschluss wurden die Tumore zur Analyse mit der HPLC entnommen. Die MRT-Bildgebung bei 3T fand kontinuierlich während des ganzen Verlaufs statt. Mit der variablen Flipwinkel Methode wurden vor und nach Hyperthermie T1-Parameterkarten erstellt. Zusätzlich sind zeitaufgelöste T1 Messungen und Phasenmessungen während der Experi-mente durchgeführt worden. Die Phasenänderungen, die T1-Relaxationszeiten und weitere T1 abhängige Parameter (absolute und relative Änderung oder die Fläche unter der Kurve (AUC) der T1-Zeitverlaufs) wurden mit der DOX Anreicherung im dazu gehörigen Gewebe-volumen verglichen. Ergebnisse: Alle verwendeten Erwärmungsmethoden führten zu einer deutlich verbes-serten Anreicherung von DOX (4,5 23,1 ng/mg) durch den Einsatz von TSL im erwärmten Tumor. Im Gegensatz dazu lag die durchschnittliche DOX Konzentration im nicht erwärm-ten Tumor und im abdominellen Muskelgewebe bei 0,5 +- 0,1 ng/mg. Unabhängig von der verwendeten HT Methode wurde mehr DOX in den kleineren Tumoren gefunden. Das Wasserbad führte zur geringsten Anreicherung in den großen Tumoren, zeigte jedoch im Gegensatz zu den nicht erwärmten Tumoren immer noch eine vierfach höhere DOX-Anreicherung. Die Erwärmung mit dem Laserapplikator führte zu einer 13-fach höheren DOX Anreicherung für die großen Tumore und einer 15-fach höheren DOX-Anreicherung in den kleinen Tumoren im Vergleich zum nicht erwärmten Tumor. Die Temperaturgradi-enten im Tumor bei Erwärmung mit dem Laserapplikator oder der Kaltlichtlampe ( 0,3 °C/mm bis - 0,5 °C/mm) waren höher im Vergleich zu denen des Wasserbads ( 0,1 °C/mm bis -0,2 °C/mm) Die MRT-Experimente im zweiten Teil der Arbeit zur Chemodosimetrie wurden bei einer mittleren Tumortemperatur von 41.1 ± 1,2 °C während einer Stunde in Gruppe A durchge-führt. Die HPLC Analyse der 18 Tumorproben zeigte eine sehr effiziente DOX Anreicherung im erwärmten Tumor im Vergleich zu den nicht erwärmten Tumoren. Die DOX An-reicherung war um einen Faktor von 9,4 ± 2,9 höher. Alle untersuchten T1 und Phasenpa-rameter besaßen eine hohe Korrelation mit der HPLC gemessenen DOX Konzentration. Unter der Verwendung der hoch signifikanten linearen Abhängigkeit der MR Parameter und der DOX-Werte wurden DOX Konzentrationskarten der Tumore berechnet. Fazit: Die Vergleichsstudie mit unterschiedlichen Erwärmungsmethoden hat gezeigt, dass unabhängig von der Erwärmungsmethode ein sehr effektiver zielgerichteter Medikamen-tentransport und –freisetzung mit DPPG2-TSL erreicht wird. Gleichwohl ist die Höhe der Effektivität sowohl von der Methode als auch von der Tumorgröße abhängig. Diese beiden Faktoren sollten somit in weiteren Studien und bei dem Vergleich von Ergebnissen ver-schiedener Studien zur temperaturinduzieren Medikamentenfreisetzung berücksichtigt werden. In dieser Studie ist eine effektivere Medikamentenanreicherung im Tumorgewebe durch die Erwärmung mit der Kaltlichtlampe oder dem neu entwickeltem Laserlichtappli-kator im Vergleich zur Erwärmung mit dem Wasserbad erreicht worden. Erstmals konnte auch gezeigt werden, dass auch eine Mischung aus TSL, die entweder ein klinisches zugelassenes MR CA oder DOX enthielten, zur Messung einer in vivo DOX Gewebekonzentration verwendet werden kann. Eine Vielzahl von statischen und dynamischen T1 oder phasenbasierenden MRT Parametern korrelierten mit der DOX Kon-zentration im Tumorgewebe. Damit waren eine Abschätzung des im Tumorgewebe plat-zierten DOX mit dem MRT und eine entsprechende Visualisierung der DOX-Verteilung im Tumor möglich. Die MR-Thermometrie wurde durch die CA-TSL beeinträchtigt, jedoch konnten die gleichen Phaseninformationen stattdessen für die DOX-Abschätzung genutzt werden. Lokale Unterschiede in der DOX-Gewebekonzentration zeigen, dass die Visualisie-rung der Medikamentenfreisetzung und der Medikamentenaufnahmen für eine weitere Verbesserung der zielgerichteten Chemotherapie wichtige zusätzliche Informationen lie-fern können.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: MRT, Liposome, Chemotherapie, Chemodosimetrie,
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 29. November 2017
• 1. Bericht­erstatter:in: Lindner, Lars